Modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo murino de lesão de isquemia pulmonar e reperfusão

Resumo

O protocolo descreve um método viável, confiável e reprodutível de pinçamento hilar pulmonar esquerdo que pode ser usado para estudar a lesão de isquemia-reperfusão pulmonar em modelos de camundongos.

Resumo

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) durante o transplante pulmonar é um importante fator de risco para complicações pós-transplante, incluindo disfunção primária do enxerto, rejeição aguda e crônica e mortalidade. Os esforços para estudar os fundamentos do IRI levaram ao desenvolvimento de um modelo de camundongo confiável e reprodutível de pinçamento hilar do pulmão esquerdo. Este modelo envolve um procedimento cirúrgico realizado em um camundongo anestesiado e intubado. Uma toracotomia esquerda é realizada, seguida por mobilização pulmonar cuidadosa e dissecção do hilo pulmonar esquerdo. O clamp hilar envolve a ligadura de sutura reversível do hilo pulmonar com um nó corrediço, que interrompe a entrada arterial, o fluxo venoso e o fluxo de ar através do brônquio principal esquerdo. A reperfusão é iniciada pela remoção cuidadosa da sutura. Nosso laboratório utiliza 30 min de isquemia e 1 h de reperfusão para o modelo experimental nas investigações atuais. No entanto, esses períodos de tempo podem ser modificados dependendo da questão experimental específica. Imediatamente antes do sacrifício, a gasometria arterial pode ser obtida do ventrículo esquerdo após um período de 4 minutos de pinçamento hilar direito para garantir que os valores de PaO₂ obtidos sejam atribuídos apenas ao pulmão esquerdo lesado. Também descrevemos um método para medir o extravasamento celular com citometria de fluxo, que envolve injeção intravenosa de um anticorpo marcado com fluorocromo específico para a(s) célula(s) a ser(em) estudada(s) antes do sacrifício. O pulmão esquerdo pode então ser colhido para citometria de fluxo, congelado ou fixo, imuno-histoquímica embebida em parafina e reação em cadeia da polimerase quantitativa. Esta técnica de pinça hilar permite um estudo detalhado dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à IRI. Resultados representativos revelam diminuição da oxigenação do pulmão esquerdo e evidência histológica de lesão pulmonar após pinçamento hilar. Essa técnica pode ser prontamente aprendida e reproduzida por funcionários com e sem experiência em microcirurgia, levando a resultados confiáveis e consistentes e servindo como um modelo amplamente adotável para o estudo da IRI pulmonar.

Introdução

A IRI durante o transplante de órgãos é um importante fator de risco para disfunção primária do enxerto e episódios posteriores de rejeição do enxerto ^1,2. Durante o transplante, o tempo de isquemia quente é definido como o período de tempo desde o pinçamento cruzado aórtico do doador até o início da perfusão fria e desde a remoção do órgão do gelo até o implante do órgão. O tempo de armazenamento refrigerado é definido como o período de tempo desde o início da perfusão fria até a remoção do órgão do gelo³. A isquemia quente é mais deletéria para a função orgânica tardia do que a isquem....

Protocolo

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Os animais receberam cuidados humanos em conformidade com o Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório,^8ª edição²¹ preparado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde, e os Princípios de cuidados com animais de laboratório formulados pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica.

1. Anestesia e intubação

1. Selecione um mouse que pese pelo menos 25 g. Isso facilitará a intubação devido ao orifício ....

Discussão

Descrevemos uma técnica de pinça hilar que envolve a aplicação de um nó corrediço no hilo esquerdo que oclui a artéria pulmonar e veias e brônquios para induzir isquemia quente seguida de reperfusão. Após o pinçamento hilar, o pulmão esquerdo pode ser colhido para uma variedade de técnicas experimentais, como histologia, citometria de fluxo, sequenciamento em massa ou de célula única e reação em cadeia da polimerase quantitativa. Além disso, o sangue e o baço podem ser usados para estudar os efeitos si.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection