Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Resumo

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Resumo

O transporte axonal é um pré-requisito para fornecer proteínas axonais de seu local de síntese no corpo celular neuronal até seu destino no axônio. Consequentemente, a perda do transporte axonal prejudica o crescimento e a função neuronal. Estudar o transporte axonal, portanto, melhora nossa compreensão da biologia celular neuronal. Com as recentes melhorias na edição do genoma CRISPR Cas9, a marcação endógena de cargas axonais tornou-se acessível, permitindo ir além da visualização do transporte baseada em expressão ectópica. No entanto, a marcação endógena geralmente tem o custo de baixa intensidade de sinal e requer estratégias de otimização para obter dados robustos. Aqui, descrevemos um protocolo para otimizar a visualização do transporte axonal, discutindo parâmetros de aquisição e uma abordagem de branqueamento para melhorar o sinal de carga marcada endógena sobre fundo citoplasmático difuso. Aplicamos nosso protocolo para otimizar a visualização de precursores de vesículas sinápticas (SVPs) marcados por RAB-3 marcado com proteína fluorescente verde (GFP) para destacar como o ajuste fino dos parâmetros de aquisição pode melhorar a análise da carga axonal marcada endogenamente em Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introdução

Ao longo da vida, os neurônios dependem do transporte axonal para entregar proteínas, lipídios e outras moléculas do corpo celular ao seu destino final no axônio. Consequentemente, o comprometimento do transporte axonal está associado a uma perda da função neuronal e está frequentemente envolvido na patologia de distúrbios neurodegenerativos ^1,2. Portanto, entender os mecanismos subjacentes ao transporte axonal é de grande interesse.

Várias décadas de pesquisa sobre o transporte axonal revelaram muitos insights importantes sobre a maquinaria molecular que medeia esse transporte, sua composição e mecanismos regulatórios. O transporte axonal de longo alcance ocorre no citoesqueleto dos microtúbulos, que consiste em polímeros de microtúbulos parcialmente sobrepostos que são tipicamente orientados com sua extremidade positiva nos axônios³. Consequentemente, o transporte anterógrado é mediado por proteínas motoras que caminham até a extremidade positiva dos microtúbulos, as cinesinas, enquanto o transporte retrógrado depende do motor de dineína direcionado para a extremidade negativa. Embora muitos aspectos do transporte tenham sido revelados, para muitas proteínas axonais ainda não está claro como elas são carregadas no maquinário de transporte, como os pacotes de transporte individuais são organizados e como esse transporte é regulado³.

O transporte axonal foi inicialmente estudado em experimentos de radiomarcação, nos quais aminoácidos radiomarcados foram injetados no compartimento somático, onde foram incorporados em proteínas endógenas nascentes e puderam ser rastreados ao longo do tempo no compartimento axonal por autorradiografia⁴. Embora os experimentos de radiomarcação tenham permitido o estudo do transporte axonal de proteínas endógenas in vivo, eles não permitem o acompanhamento direto do comportamento da carga individual para obter insights mecanicistas⁴. Essa limitação foi superada com o uso da microscopia de fluorescência. No entanto, o transporte axonal geralmente não é visualizado em proteínas endógenas, mas sim pela expressão de uma cópia marcada com fluorescência. Especialmente para proteínas de baixa expressão, a superexpressão fornece intensidades de sinal mais altas que tornam possível a visualização, de preferência com resolução de um único neurônio. Além disso, a expressão ectópica da proteína marcada com fluorescência contorna a necessidade e os desafios da edição do genoma. Por outro lado, tem sido argumentado que o comportamento da carga expressa ectopicamente pode diferir do comportamento da carga endógena⁵.

Melhorias recentes na edição do genoma tornaram as estratégias de marcação endógena mais acessíveis. Assim, uma menor intensidade de sinal tornou-se a principal limitação para estudar o transporte axonal de uma carga por expressão ectópica em vez de marcação endógena. Considerações cuidadosas na estratégia de marcação endógena combinadas com uma otimização das condições de aquisição podem superar esse desafio.

Os nematóides fornecem um excelente modelo de pesquisa para estudar o transporte axonal in vivo devido à sua transparência e facilidade nas manipulações genéticas. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de pesquisa para visualizar o transporte axonal de proteínas endógenas com resolução de neurônio único em Caenorhabditis elegans vivos. Visualizamos o transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas usando uma cepa gerada pelo Jorgensen Lab⁶, na qual a RAB GTPase associada à vesícula, RAB3, é marcada endogenamente com GFP, no neurônio motor DA9. Ao perguntar como pequenas adaptações em diferentes parâmetros de aquisição e fotobranqueamento podem melhorar a visualização de eventos de transporte individuais, o protocolo fornece ideias sobre como otimizar as condições de imagem.

Protocolo

Para um protocolo detalhado sobre como manter e preparar nematóides para imagens de células vivas, consulte o trabalho de S.Niwa ⁷.

1. Geração de cepas de vermes

Além de gerar cepas de nematóides, o Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ contém uma coleção crescente de cepas de nematóides com proteínas marcadas com fluorescência endogena que podem ser obtidas diretamente de sua página da web.

1. Escolha da estratégia de rotulagem de fluorescência
   1. Use a cepa nematóide MTS1161, que contém o alelo⁶ rab-3 (ox699), para visualizar a GFP endógena marcada com RAB-3 no neurônio motor DA9 (a cepa será depositada no CGC). Para visualizar outras proteínas axonais, gere uma cepa de nematóide com uma proteína marcada endógena usando o protocolo de edição CRISPR Cas9 do Mello Lab⁹.
      NOTA: MTS1161 utiliza uma abordagem de recombinação para a célula rotular especificamente o RAB-3 endogenamente com uma tag GFP⁶. Uma abordagem alternativa comum é baseada na reconstituição de uma proteína fluorescente dividida, que é recomendada para proteínas especialmente de baixa expressão, pois aumenta o número de cópias fluorescentes por proteína endógena usando múltiplas cópias fluorescentes divididas¹⁰. O número de cópias pode ser inicialmente estimado com base em conjuntos de dados de transcriptoma da página da CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Escolha do neurônio para visualizar o transporte axonal
   1. No MTS1161 de tensão, visualize RAB-3 no neurônio motor DA9 (ver Figura 1). Para outras cargas axonais, especialmente proteínas de baixa expressão, identifique um neurônio no qual os níveis de expressão da proteína analisada são mais altos usando a página da CenGen.
      NOTA: O projeto CenGen (cengen.org) fornece um ótimo recurso on-line para estimar os níveis de expressão de uma proteína de interesse em muitos neurônios do nematóide com base em um grande conjunto de dados transcriptômicos cobrindo todos os 302 neurônios do sistema nervoso de C. elegans ^12,13.

2. Manuseio de vermes e preparação para imagens

1. Mantenha os nematóides em um gramado de bactérias (cepa: OP50) semeadas em placas de meio de crescimento de nematóides a 20 ° C e cultivadas até a idade adulta de 1 dia para obter imagens.
   NOTA: Medir o transporte axonal em um estágio de idade definido é importante, pois as taxas de transporte diminuem com o envelhecimento de forma consistente em diferentes cargas axonais, classes de neurônios e organismos 14,15,16,17,18-Nematóides no estágio larval L4 ou 1 dia na idade adulta têm sido usados na maioria dos artigos e, portanto, oferecem os maiores conjuntos de dados para comparações.
2. Prepare nematóides para imagens de células vivas: Execute todas as etapas subsequentes com um microscópio estéreo para visualizar e manusear os vermes.
   1. Transfira os nematóides para uma gota de 0,5 mM de Levamisol usando um palito de fio de platina e incube os nematóides por 20 min na gota.
   2. Monte cuidadosamente 10-20 nematóides da gota de Levamisol em uma gota de 12 μL de meio M9 em um adesivo de agarose a 10% (dissolvido em meio M9) em uma lâmina de vidro usando um palito de cabelo. Para um procedimento detalhado sobre como fazer um adesivo de agarose a 10%, consulte o protocolo de S.Niwa⁷.
      NOTA: A montagem de um número baixo de nematóides é suficiente, pois apenas alguns animais serão fotografados por lâmina antes que os animais comecem a sofrer de hipóxia.
   3. Coloque uma lamínula em cima da gota (22 mm x 22 mm ou 18 mm x 18 mm). Para o transporte de imagens no axônio DA9, posicione o axônio próximo à lamínula. Para isso, gire a lamínula em 45° depois de colocá-la em cima do remendo de ágar, para rolar os animais de costas.
   4. Sele o espaço entre a lamínula e a lâmina de vidro com um gel viscoso como petrolato. Isso evitará que a mancha de agarose seque, o que pode fazer com que os nematóides saiam do campo de imagem.
      NOTA: É crucial tratar os animais com a maior delicadeza possível. Concentrações muito altas de levamisol ou danos físicos ao verme podem prejudicar o transporte axonal. Contrações leves da cauda durante a sessão de imagem são um bom sinal de que o animal permanece em um estado saudável. Os animais permanecem saudáveis e podem até se recuperar da mancha de agarose após a sessão de imagem.

3. Microscopia de células vivas

NOTA: Os valores exatos dos parâmetros de aquisição podem diferir entre os microscópios. No entanto, as tendências para cada parâmetro de aquisição devem ser independentes do microscópio utilizado. Um microscópio confocal de disco giratório equipado com uma linha de laser separada para branqueamento foi usado neste protocolo (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o microscópio). A fluorescência verde foi excitada por um laser de 488 nm e a emissão foi filtrada por um filtro de emissão ET525/36. O clareamento foi realizado com uma linha de laser de 488 nm.

1. Certifique-se de que a temperatura da sala, ou se um stage com temperatura controlada estiver disponível, esteja ajustado para uma temperatura constante. Para os nemátodos, regular a temperatura para 20 °C.
2. Monte a lâmina e use a lente objetiva com ampliação de 4x-20x para localizar os nematóides na lâmina e memorizar as posições. Mude para lente de ampliação de 63x para aquisição de imagem.
3. Tire uma única imagem para verificar os parâmetros de aquisição inicial. Acompanhe as intensidades do sinal no campo de visão com o histograma de intensidade do software de aquisição. Os valores de intensidade devem cobrir o terço mais baixo do sinal máximo que a câmera pode detectar. Evite a saturação de pixels. Aumente a intensidade do laser de excitação se a intensidade do sinal for muito baixa.
   NOTA: Não use intensidades de laser de excitação muito altas, pois ele branqueia a proteína fluorescente durante o lapso de tempo.
4. Altere o parâmetro de aquisição e as etapas aqui para otimizar a detecção do sinal de fluorescência.
   1. Implementação de uma etapa de branqueamento: Branquear a região do axônio que será analisada usando uma linha de laser de 488 nm (potência: 15 mW) para a etapa de clareamento. Procure uma eficiência de branqueamento de pelo menos 90%. Determine a eficiência do branqueamento comparando a intensidade do sinal da região antes e depois da etapa de branqueamento.
      NOTA: O branqueamento aumenta o sinal de partículas em movimento, diminuindo o sinal que deriva de partículas estacionárias, bem como do sinal que deriva da fração citoplasmática da proteína em segundo plano. A carga membranosa, como o RAB-3 em precursores de vesículas sinápticas, tem uma fração citoplasmática baixa, de modo que a etapa de branqueamento melhora apenas levemente o sinal do pacote de transporte sobre o fundo citoplasmático ( Figura 2A , D ). No entanto, o branqueamento melhora o rastreamento de eventos de transporte individuais em distâncias maiores e permite quantificar os tempos de pausa (Figura 2A).
   2. Compartimentalização: Use a compartimentalização 2 x 2 para aumentar a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais. O compartimentalização combina matrizes de pixels em um pixel maior. Isso reduzirá a resolução espacial, mas aumentará a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais e é especialmente útil para partículas fracas (Figura 2B, D).
   3. Tempo de exposição: Aumente o tempo de exposição para aumentar a intensidade do sinal. Aumentar o tempo de exposição aumenta a intensidade do sinal da amostra ao custo de obter uma resolução temporal mais baixa para os eventos de transporte. Para o experimento aqui, use uma resolução temporal de 300 ms a 700 ms entre pontos de tempo consecutivos (tempo de exposição de 100-500 ms) para seguir eventos de transporte individuais de RAB-3. (Figura 2C, D)
5. Gravação de lapso de tempo: Faça um lapso de tempo de pelo menos 1-3 minutos, dependendo da intensidade do sinal da proteína, bem como da frequência de eventos de transporte individuais. Uma vez que um lapso de tempo tenha sido registrado, passe para o próximo animal. Os animais em uma lâmina não devem ser fotografados por mais de 30 minutos para garantir que os animais registrados estejam em um estado saudável.
   NOTA: Contrações leves da cauda dos animais durante a gravação são um indicador de que o animal ainda está vivo.

4. Análise de dados de transporte axonal

NOTA: Use ImageJ/Fiji¹⁹ para as etapas subsequentes de análise de imagem. Fiji é capaz de ler dados por todos os pacotes de software de microscopia comuns.

1. Geração de Kymograph
   1. Importar dados: Importe o arquivo de dados de lapso de tempo para Fiji. Caso não seja possível importar os dados para Fiji, exporte a gravação de tempo como um arquivo tiff do pacote de software e carregue-o posteriormente em Fiji.
   2. Correção de desvio: Verifique se o segmento animal/axônio se moveu ou se desviou ligeiramente durante a aquisição da imagem. Corrija o movimento ou deriva do animal executando o plugin StackReg²⁰. Ao executar o plug-in, escolha a transformação Corpo rígido .
   3. Geração manual de um quimógrafo: Um procedimento passo a passo detalhado é fornecido na Figura 3. Utilize o filme corrigido por desvio para gerar o quimógrafo. Use a ferramenta Linha segmentada e ajuste a largura da linha para corresponder ao diâmetro do axônio clicando duas vezes com o botão esquerdo do mouse no ícone da linha segmentada para desenhar uma linha ao longo do segmento do axônio que será analisado. Execute o plug-in ImageJ/Fiji Kymoreslicewide para gerar o quimógrafo e utilizar o valor de intensidade máxima em toda a largura da linha em suas configurações de parâmetro.
      NOTA: Manter a consistência na direção do desenho da linha (por exemplo, sempre proximal ao axônio distal ou reverso) simplifica o rastreamento da direção do movimento de volta nos quimógrafos.
2. Análise do parâmetro de transporte
   1. Calcule o parâmetro de transporte: número do evento, velocidade, duração da corrida e duração da pausa do quimógrafo seguindo as etapas subsequentes.
      1. Rastrear eventos de transporte no quimógrafo: Use a ferramenta Linha reta para rastrear eventos de transporte individuais no quimógrafo. Salve cada linha no gerenciador de ROI e rastreie todos os eventos de transporte no kymograph. Escolha os seguintes parâmetros de medição no ImageJ/Fiji: Área, Retângulo delimitador, Valor médio de cinza, Diâmetro de Feret.
      2. Calcular parâmetro de transporte: cole a tabela de resultados em uma planilha e use as seguintes colunas das seções de resultados para calcular:
         Comprimento da corrida: Multiplique a largura (em pixels) pela resolução da câmera (por exemplo, x μm/pxl) para determinar o comprimento da corrida em μm.
         Velocidade: Duração da corrida/duração da execução. Para determinar a duração de um evento de movimento em segundos, multiplique a altura (em pixels) pelo tempo de aquisição entre pontos de tempo consecutivos (por exemplo, x s/pixel).
         Tempo de pausa: Duração da execução entre dois movimentos consecutivos em que a velocidade é 0.
         Número do evento: O total de eventos pode ser normalizado para o comprimento total do quimógrafo para determinar o número de eventos por minuto e o segmento de comprimento do axônio. Os eventos podem ainda ser categorizados em eventos de transporte anterógrados e retrógrados. Para determinar a direcionalidade de cada evento de movimento, utilize a ferramenta Ângulo de Feret. Nos quimógrafos que foram inicialmente gerados desenhando a linha segmentada de proximal para distal e os eventos de transporte anterógrado no quimógrafo estão apontando da direita para a esquerda, um ângulo de Feret < 90° indicará um evento anterógrado e >90° um evento retrógrado, caso contrário, será o inverso.

Resultados

Visão geral do sistema de modelo e procedimento de medição
Para visualizar o transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas, rastreamos endogenamente GFP marcado com RAB-3. Aqui fazemos uso de uma cepa⁶ GFP::Flip-on::RAB-3 recentemente gerada, na qual a expressão da Flippase recombinase sob um promotor específico de célula (glr-4p) rotula RAB-3 endógena no neurônio motor DA9. DA9 é um neurônio motor bipolar, com s...

Discussão

Limitações do método e métodos alternativos
Neste protocolo, otimizamos os parâmetros de aquisição para visualizar o transporte axonal do RAB-3 marcado endogenamente, que está associado a precursores de vesículas sinápticas. Para visualizar o RAB-3, usamos uma cepa⁶ FLIP-on::GFP::RAB-3 publicada recentemente e expressamos a Flippase recombinase sob um promotor específico de célula (glr-4p)²⁵. Essa estratégia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)