Medindo a colonização bacteriana em raízes de Arabidopsis thaliana em condição hidropônica

Resumo

A colonização de rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPR) na rizosfera é essencial para seu efeito promotor de crescimento. É necessário padronizar o método de detecção da colonização da rizosfera bacteriana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para quantificar a colonização bacteriana na superfície da raiz.

Resumo

A medição da colonização bacteriana na raiz de Arabidopsis thaliana é um dos experimentos mais frequentes em estudos de interação planta-micróbio. Um método padronizado para medir a colonização bacteriana na rizosfera é necessário para melhorar a reprodutibilidade. Primeiro cultivamos A.thaliana estéril em condições hidropônicas e, em seguida, inoculamos as células bacterianas na rizosfera a uma concentração final de OD₆₀₀ de 0,01. Aos 2 dias após a inoculação, o tecido radicular foi colhido e lavado três vezes em água estéril para remover as células bacterianas não colonizadas. As raízes foram então pesadas e as células bacterianas colonizadas na raiz foram coletadas por vórtice. A suspensão celular foi diluída em um gradiente com tampão tampão salino tampão fosfato (PBS), seguido de plaqueamento em meio de ágar Luria-Bertani (LB). As placas foram incubadas a 37 °C por 10 h e, em seguida, as colônias únicas nas placas LB foram contadas e normalizadas para indicar as células bacterianas colonizadas nas raízes. Este método é usado para detectar colonização bacteriana na rizosfera em condições de monointeração, com boa reprodutibilidade.

Introdução

Existem métodos quantitativos e qualitativos para detectar a colonização da rizosfera por uma única cepa bacteriana. Para o método qualitativo, deve-se utilizar uma cepa que expresse constitutivamente a fluorescência, e a distribuição e intensidade da fluorescência devem ser examinadas em microscopia de fluorescência ou instrumentos confocais a laser ^1,2. Essas estratégias podem refletir bem a colonização bacteriana in situ³, mas não são tão precisas quanto os métodos tradicionais de contagem de placas na quantificação. Além disso, devido à limitação de exibir apenas zonas radi....

Protocolo

1. Cultivo hidropônico estéril de A. thaliana

1. Prepare mudas de A. thaliana .
   1. Prepare o meio de mudas de cultura A. thaliana , que consiste em meio 1/2 MS (Murashige e Skoog) com 2% (peso / vol) de sacarose e 0,9% (peso / vol) de ágar.
   2. Despeje o meio de esterilização preparado em placas de Petri quadradas estéreis (13 cm x 13 cm) antes da solidificação. Evite secar ao ar para manter a umidade.
   3. Mergulhe as sementes de A. thaliana em um tubo de microcentrífuga de 2 mL cheio de 1 mL de água estéril a 4 ° C por mais de 12 h e, em seguida, esterilize as sementes com ....

Discussão

Para obter uma boa reprodutibilidade, existem quatro etapas críticas para o processo de detecção de colonização deste protocolo. Primeiro, é necessário garantir que o número de células bacterianas inoculadas seja exatamente o mesmo em cada experimento. Em segundo lugar, também é necessário controlar a intensidade da limpeza de bactérias não colonizadas com água estéril. Terceiro, cada processo de diluição da amostra precisa ser submetido a vórtice antes de ser realizado para permitir que a amostra este.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E