Gerando Retina Neural a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Resumo

O presente protocolo descreve um sistema otimizado de indução de retina neural 3D que reduz a adesão e fusão de organoides da retina com alta repetibilidade e eficiência.

Resumo

A retinopatia é uma das principais causas de cegueira no mundo. A investigação de sua patogênese é essencial para o diagnóstico precoce e tratamento oportuno da retinopatia. Infelizmente, barreiras éticas dificultam a coleta de evidências de seres humanos. Recentemente, numerosos estudos têm mostrado que células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) podem ser diferenciadas em organoides da retina (ROs) usando diferentes protocolos de indução, que têm enorme potencial na retinopatia para modelagem de doenças, triagem de drogas e terapias baseadas em células-tronco. Este estudo descreve um protocolo de indução otimizado para gerar retina neural (NR) que reduz significativamente a probabilidade de vesiculação e fusão, aumentando a taxa de sucesso de produção até o 60º dia. Baseado na capacidade das LSPs de se auto-reorganizarem após a dissociação, combinada com certos fatores complementares, esse novo método pode direcionar especificamente a diferenciação da NR. Além disso, a abordagem é descomplicada, custo-efetiva, exibe repetibilidade e eficiência notáveis, apresenta perspectivas encorajadoras para modelos personalizados de doenças da retina e fornece um reservatório celular abundante para aplicações como terapia celular, triagem de drogas e testes de terapia gênica.

Introdução

O olho serve como fonte primária de informação entre os órgãos sensoriais humanos, sendo a retina o principal tecido sensorial visual dos olhos de^mamíferos1. A retinopatia destaca-se como uma das principais causas globais de doenças oculares, levando à^cegueira2. Aproximadamente 2,85 milhões de pessoas no mundo sofrem de graus variados de comprometimento da visão devido à retinopatia³. Consequentemente, a investigação de sua patogênese é crucial para o diagnóstico precoce e tratamento oportuno. A maioria dos estudos sobre retinopatia humana tem se concentrado principalmente em modelos animais ^4,5,6. No entanto, a retina humana é um tecido complexo e multicamadas, composto por vários tipos celulares. Os sistemas tradicionais de cultura de células bidimensionais (2D) e modelos animais tipicamente falham em recapitular fielmente o desenvolvimento espaço-temporal normal e o metabolismo de drogas da retina humana nativa ^7,8.

Recentemente, técnicas de cultura 3D evoluíram para gerar órgãos semelhantes a tecidos a partir de células-tronco pluripotentes (CTPs)^9,10. Os organoides (ROs) da retina gerados a partir de LSPs humanas em um sistema de cultura em suspensão 3D não apenas contêm sete tipos de células retinianas, mas também exibem uma estrutura estratificada distinta, semelhante à retina humana in vivo11,12,13. As ERs derivadas de LSP humanas têm ganhado popularidade e ampla disponibilidade e são atualmente os melhores modelos in vitro para o estudo do desenvolvimento e da doença da retina humana^14,15. Ao longo das últimas décadas, numerosos pesquisadores demonstraram que as PSCs humanas, incluindo células-tronco embrionárias (CTEs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), podem se diferenciar em ROs usando vários protocolos de indução. Esses avanços têm enorme potencial na retinopatia para modelagem de doenças, rastreamento de drogas e terapias baseadas em células-tronco 16,17,18.

No entanto, a geração de retina neural (NR) a partir de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) é um processo complexo, complicado e demorado. Além disso, variações lote a lote nos organoides teciduais podem levar a menor reprodutibilidade dos resultados^19,20. Inúmeros fatores intrínsecos e extrínsecos podem influenciar o rendimento dos organoides (ROs) da retina, como o número ou espécie de células iniciadoras e o uso de fatores de transcrição e compostos de moléculas pequenas 21,22,23. Desde que a primeira OR humana foi gerada pelo laboratório Sasai¹¹, múltiplas modificações foram propostas ao longo dos anos para aumentar a facilidade e a eficácia do processo de indução 13,21,24,25. Infelizmente, até o momento, nenhum protocolo padrão-ouro foi estabelecido para a geração de ROs em todos os laboratórios. De fato, há certo grau de discrepância nas ER decorrentes dos diferentes métodos de indução, bem como grande variação na expressão dos marcadores retinianos e na robustez de sua estrutura^22,26. Essas questões podem complicar gravemente a coleta de amostras e a interpretação dos achados do estudo. Portanto, um protocolo de diferenciação mais consolidado e robusto é necessário para maximizar a eficiência com o mínimo de heterogeneidade da geração de OR.

Este estudo descreve um protocolo de indução otimizado baseado na combinação de Kuwahara et ^al.12 e Döpper et ^al.27 com instruções detalhadas. O novo método reduz significativamente a probabilidade de vesiculação e fusão organoide, aumentando a taxa de sucesso na geração de NR. Esse desenvolvimento é uma grande promessa para modelagem de doenças, triagem de drogas e aplicações de terapia celular para distúrbios da retina.

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Geral Chinês PLA. A linhagem WA09 (H9) ESC foi obtida do WiCell Research Institute.

1. Meios de cultura e preparação de reagentes

1. Meio de cultura ESC humano e solução de passagem
   1. Meio de manutenção (MM): Preparar 500 mL de MM completo (Meio Basal + suplemento 5x; ver Tabela de Materiais) assepticamente. Descongelar 5x suplemento à temperatura ambiente (RT) ou durante a noite a 2-8 °C. Mexa bem antes de usar até que o suplemento esteja livre de turvação.
   2. Matriz extracelular (MEC) a 1%: Use uma ponta de pipeta pré-refrigerada e tubos estéreis para dispensar 200 μL de MEC (ver Tabela de Materiais) por tubo sobre gelo. Conservar os tubos num congelador a -20 °C. Derreter o ECM no gelo e diluir com DMEM/F12 pré-resfriado às 1:100.
   3. 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Para preparar 500 mL de EDTA 0,5 mM, adicione 500 μL de EDTA 0,5 M e 0,9 g de NaCl a 500 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco (ver Tabela de Materiais). Misture bem e guarde a 2-8 °C.
2. Meio de diferenciação retiniana
   1. Meio quimicamente definido livre de fator de crescimento (gfCDM): Prepare o gfCDM combinando 45% de GlutaMAX modificado de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM-GlutaMAX), 45% de F12-GlutaMAX de Ham, 10% de reposição de soro nocaute (KSR), 1% de concentrado lipídico de colesterol e 450 μM de tioglicerol (ver Tabela de Materiais).
3. Compostos de moléculas pequenas
   1. Y-27632 2HCl: Adicionar 50 mg de pó de Y-27632 a 3,122 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Dispensar e armazenar Y-27632 (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 50 mM a -80 °C durante 2 anos, mantendo-se afastado da luz. Diluir o estoque 2.500 vezes (20 μM) para uso, equivalente a 0,4 μL de Y-27632 por mL de gfCDM.
   2. IWR1-endo: Adicionar 2,4424 ml de DMSO para dissolver 10 mg de IWR1-endo (ver Tabela de Materiais) para obter uma solução-mãe de 10 mM. Dispense alíquotas e guarde-as a -80 °C por até 2 anos. Adicionar 0,3 μL de 10 mM de IWR1-endo por mL de gfCDM para a concentração de 3 μM para indução.
   3. SB431542: Para preparar 50 mM de SB431542, adicionar 10 mg de SB431542 (ver Tabela de Materiais) a 0,5203 mL de DMSO e misturar completamente. Conservar a -80 °C em solvente durante um período máximo de 2 anos. Para a preparação de SB431542 a uma concentração de trabalho de 10 μM, adicionar 2 μL da solução-mãe de 50 mM a 10 ml de gfCDM.
   4. LDN-193189 2HCl: Dissolver 5 mg de LDN-193189 2HCl (ver Tabela de Materiais) em 10,4297 mL de DMSO para obter 1 mM de solução-mãe. Conservar a -20 °C ou -80 °C (conforme recomendado pelo fabricante). Adicionar 0,1 μL do estoque a cada 10 mL de gfCDM, resultando em 100 nM de LDN-193189 para indução.
   5. Proteína morfogenética óssea humana recombinante 4 (BMP4): Reconstituir a 50-200 μg/ml em HCl 4 mM (ver Tabela de Materiais). Conservar a 2 °C a 8 °C durante 1 mês ou -20 °C durante 1 ano após a reconstituição. Realizar indução de NR utilizando BMP4 de 1,5 nM.
4. Média de cultura de NR de longa duração
   1. Ácido retinóico (RA): Medir 6 mg de pó de RA (ver Tabela de Materiais) e adicionar a 3,9941 ml de DMSO. Conservar em alíquotas de 5 mM a -80 °C e utilizar no prazo de 3 meses. Para atingir uma concentração de trabalho de 0,5 μM, adicione 10 μL da mistura mestre a 100 mL de meio de diferenciação da retina neural (NRDM). Adicione um pouco antes de usar.
      NOTA: Manter longe da luz durante a preparação e armazenamento.
   2. Taurina: Adicionar taurina em pó (ver Tabela de Materiais) pesando 200 mg a 7,9904 mL de DMSO para obter uma solução-mãe de 200 mM. Dispensar e conservar a 2-8 °C. Uma concentração de trabalho de 0,1 mM de taurina é obtida pela adição de 50 μL da solução-mãe por 100 mL de NRDM.
   3. NRDM: Compor NRDM com meio DMEM/F12-GlutaMAX, suplemento de N2 a 1%, 10% de soro fetal bovino, 0,5 mM de RA e 0,1 mM de taurina (ver Tabela de Materiais). Conservar a 2-8 °C até 2 semanas ou 6 meses a -20 °C para garantir a atividade dos componentes.
5. Tampão de bloqueio: Diluir 1:9 com DPBS para obter uma solução de trabalho de 10% para uso (consulte a Tabela de Materiais). Conservar a -20 °C até 5 anos.
   OBS: Realizar todos os demais procedimentos em um Gabinete de Biossegurança Classe II para garantir a esterilidade, exceto a pesagem. Se for necessária a adição de reagentes pesados durante o processo de preparação, utilizar filtros de 0,22 μm para filtração.

2. Cultura de H9-ESCs

1. Descongelamento de H9-ESCs
   1. Adicionar 1 mL de ECM a 1% a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar durante 1 h numa incubadora a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO₂ .
      OBS: Evite a adição de ECM ao longo das paredes do poço, pois ele pode grudar na superfície.
   2. Pegue um estoque criovial H9-ESC do tanque de nitrogênio líquido e agite-o rapidamente em água a 37 °C por 30 s.
      NOTA: Não permita que o frasco para injetáveis descongele completamente.
   3. Retire o frasco para injetáveis e esterilize-o cuidadosamente com spray de álcool desinfetante a 75%. Adicionar o H9-ESC descongelado do criovial a um tubo de 15 mL contendo 9 mL MM com 10 μM Y-27632.
   4. Centrifugar o tubo a 190 × g por 5 min na RT. Remover cuidadosamente a maior parte do sobrenadante com uma pipeta de 1 mL, deixando aproximadamente 50 μL de sobrenadante para evitar a perda celular.
   5. Adicionar 1 mL de MM contendo 10 μM de Y27632 ao sedimento celular e ressuspender suavemente o sedimento celular com uma pipeta de 1 mL pipetando para cima e para baixo 5-10 vezes.
   6. Remova o revestimento de ECM após 1 h de incubação. Adicionar 2 mL de MM pré-aquecido contendo 10 μM Y-27632 a cada poço.
   7. Dispensar 0,5 mL de suspensão celular por poço. Agite suavemente a placa lateralmente para garantir uma distribuição uniforme das células.
   8. Incubar a placa a 37 °C a 5% de CO₂ durante, pelo menos, 24 horas sem a tocar.
   9. Troque o meio diariamente. Quando a densidade de clones atinge 70% ou mais, a passagem é necessária.
2. Passagem de H9-ESCs
   1. Preparar a placa revestida com MEC conforme descrito acima (passo 2.1.1) e adicionar 2 ml de MM por poço.
   2. Retire o meio gasto das placas de 6 poços. Lave cada poço duas vezes com 1 mL de DPBS.
   3. Lave cada poço duas vezes adicionando lentamente 1 mL de EDTA e incubando com 1 mL de EDTA por 4-7 min na RT.
      NOTA: Durante a incubação, examine a placa de 6 poços por 3 min sob um microscópio. Prossiga imediatamente para a próxima etapa se a maioria das células estiver perto de se desprender do prato. Evite incubação por muito tempo para reduzir o impacto negativo nas células.
   4. Descarte o EDTA e adicione 1 mL de MM para abortar a digestão.
   5. Bata suavemente na placa do poço até que a maioria das células esteja destacada.
   6. Transfira cuidadosamente a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL com uma pipeta de 5 mL. Ressuspenda suavemente as colônias H9-ESC para cima e para baixo 3-5 vezes para misturá-las com uma pitette de Pasteur. Transfira 20-100 μL de suspensão celular em uma nova placa de cultura de 6 poços revestida com ECM e agite-a para frente e para trás.
   7. Quando a densidade celular for observada como suficiente ao microscópio, incubar a placa a 37 °C a 5% de CO₂ por pelo menos 24 h sem tocá-la.
   8. Altere a mídia diariamente. Com 70% de densidade de clones e acima, a passagem é necessária.

3. Geração de NRs humanas

NOTA: Uma vez que as colônias atinjam aproximadamente 70% de confluência, elas podem ser direcionadas para a diferenciação em organoides da retina (ROs) usando as etapas do procedimento descritas na Figura 1.

1. Dia 0 - Formação do corpo embrionário (BE)
   1. Depois de lavar as células com 2 mL de DPBS, adicionar 0,5 mL de CDS (ver Tabela de Materiais) contendo 20 μM Y27632 ao poço. Incubar durante 3 min a 37 °C numa incubadora humidificada a 5% CO₂ .
      NOTA: Verifique ao microscópio. Reduzir o tempo de incubação tanto quanto possível para evitar efeitos nocivos sobre as células.
   2. Abortar a digestão adicionando 3 mL de MM contendo 20 μM Y27632. Centrifugar a 190 × g por 5 min e descartar sobrenadante.
   3. Ressuspender o pellet de células em 1 mL de gfCDM contendo 20 μM Y27632 e contar as células. Adicione o volume correspondente para 1,2 × 10⁶ células (1,2 × 10⁴ células por poço) a 10 mL de gfCDM, que é pré-incorporado com 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 e 100 nM LDN-193189 (ver Tabela de Materiais).
   4. Adicionar 100 μL de suspensão celular a cada poço de 96 poços cônicos com fundo em V. Colocar a placa em estufa umidificada com CO₂ a 5% até o 6º dia.
      OBS: Não movimente a louça por pelo menos 24 h para aumentar a aderência dos EBs.
2. Dia 6 - Indução da retina
   1. No dia 6, adicionar 10 mL de gfCDM contendo 55 ng/mL de BMP4 para permitir a troca completa do meio de cultura nas EBs. Devolva a placa à incubadora.
      NOTA: Pipetar em direção às paredes do poço cônico com fundo em V 96 para evitar bolhas de ar. Evite tomar quaisquer organoides ao mudar o meio.
   2. Realizar troca meio médio no dia 9, dia 12 e dia 15. Substitua metade do meio por gfCDM fresco para diluir gradualmente o BMP4.
3. Dia 18 - Cultura de NR de longo prazo
   1. No dia 18, transferir cuidadosamente os EBs formados para tubos centrífugos de 15 mL usando pipetas de Pasteur de 5 mL e enxaguar suavemente novamente com NRDM. Transfira os EBs para placas de 6 ou 24 poços de baixa adsorção (consulte Tabela de Materiais). Devolva a placa à incubadora.
   2. Substitua o meio por NRDM fresco a cada 3 dias.
      Observação : desligue a luz durante a mudança de meio porque o RA é sensível à luz. Remova organoides mal diferenciados e separe organoides aderentes sob um microscópio.

4. Análise de NRs humanas

1. Montagem dos ROs
   1. Selecionar diferentes gerações de H9-ESCs para induzir três lotes de ROs.
      OBS: Três placas do número de NRs formadoras para cada um dos três métodos avaliados (Kuwahara et ^al.12, Döpper et ^al.27 e o método modificado no presente estudo) são calculadas para avaliar a taxa de sucesso da indução. A indução é considerada bem-sucedida se a microscopia de luz revelar a formação de estruturas neuroepiteliais semelhantes ao 30º dia.
2. Coloração por imunofluorescência de ROs
   1. Transfira 3-5 ROs para tubos de 1,5 mL. Pipetar o meio em excesso e lavar as ROs uma vez com 1 mL de DPBS na RT. Deixe as ROs afundarem e remova cuidadosamente as DPBS. Adicionar 1 ml de paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais) por tubo de 1,5 ml e fixar a 4 °C.
      OBS: ROs no dia 6 e dia 18, fixo 2 h. Fixo para 12 h no dia 30 e 14 h no dia 60.
   2. Após a fixação, desidratar com álcool gradiente. Deixe as ROs em repouso por 15 min cada em 50%, 60% e 70% de álcool e, posteriormente, por 10 min cada em 80%, 90%, 95%, 100% e 100% de álcool. Em seguida, adicione uma mistura 1:1 de álcool 100% e xileno por 10 min, seguido de xileno duas vezes por 10 min cada.
   3. Coloque os ROs em moldes metálicos preenchidos com paraplast derretido (consulte Tabela de Materiais) por 40 min e, em seguida, tempere os moldes no gelo para fixar os ROs. Coloque caixas de embutir nos moldes e congele-as a -20 °C durante a noite. Em seguida, retire cuidadosamente as caixas de incorporação. Por fim, guarde-os na RT.
   4. Crie seções contínuas (5 μm de espessura) com uma fatia de parafina. Fixar fatias em lâminas de microscópio de adesão, secar e armazenar em RT.
   5. Realizar desparafinação e reidratação antes do reparo antigênico^12,27.
   6. Adicionar 10 ml de solução de recuperação de antigénio citrato 20x pH 6,0 (ver Tabela de Materiais) a 190 ml de ddH₂O (duplo destilado H₂O). Aqueça no micro-ondas no modo alto por 4 min até ferver. Depois de adicionar seções de parafina, aqueça as seções em modo baixo por 20 min para completar o reparo do antígeno.
   7. Deixe as seções de parafina esfriar naturalmente em uma área ventilada e, em seguida, coloque-as em uma câmara úmida.
   8. Use uma caneta de papanicolau (consulte Tabela de Materiais) para delinear as seções. Incubar com Triton X-100 a 0,2% em TR por 30 min para romper as membranas, seguido de lavar as lâminas três vezes com TPBS, por 5 min cada.
   9. Bloco com soro de burro a 10% diluído em DPBS em TR por 1 h em câmara úmida com 10 μL por área de coloração.
   10. Adicionar anticorpos primários diluídos em soro de burro a 10%. Incubar durante a noite a 4 °C numa câmara de humidade. Lave as amostras três vezes com TPBS por 10 min cada para remover o anticorpo não ligado.
       NOTA: Os anticorpos primários são os seguintes: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulina III (1: 250) e anti-NESTIN (1: 200) (ver Tabela de Materiais).
   11. Incubar com anticorpos secundários diluídos em DPBS por 1 h em RT em câmara umedecida. Repita a etapa de lavagem com TPBS três vezes por 10 min cada.
       NOTA: Manter no escuro para evitar a extinção do anticorpo secundário fluorescente. Os anticorpos secundários são Alexa Fluor 488 conjugado com IgG anti-rato de burro e Alexa Fluor 568 conjugado com IgG anti-coelho de burro a uma diluição de 1:400 (ver Tabela de Materiais).
   12. Incubar com DPBS contendo DAPI (1: 500; ver Tabela de Materiais) por 10 min no RT no escuro. Lave três vezes com TPBS por 10 min cada.
   13. Coloque uma quantidade apropriada de selante antifluorescente (consulte a Tabela de Materiais) sobre a lâmina e cubra com lamínulas.
   14. Visualize usando um analisador quantitativo de células de tecido semelhante a fluxo (consulte Tabela de Materiais) ou similar.
   15. Conservar as lâminas a -20 °C no escuro após análise microscópica.

Resultados

Uma visão geral gráfica do protocolo modificado é mostrada na Figura 1. H9-ESCs foram usadas para gerar ROs quando as células foram cultivadas a uma densidade de 70%-80%. Suspensões unicelulares de H9-ESCs em 96 poços cônicos com fundo em V se agregaram no dia 1 e formaram EBs redondas bem circunscritas no dia 6. Com o aumento do tempo de cultivo, o volume de EBs aumentou gradativamente. No 30º dia, estruturas neuroepiteliais-símile estavam claramente formadas e espessadas durante a...

Discussão

As ERs humanas podem recapitular espacial e temporalmente o desenvolvimento da retina fetal, e as ERs precoces exibem alto grau de semelhança com a retina fetal em estágios equivalentes de desenvolvimento¹⁵. Em termos de morfologia tecidual e expressão molecular, a OR humana espelha de perto o estado de crescimento real do tecido da retina, fornecendo oportunidades tremendas e sem precedentes nos campos da modelagem de doenças, triagem de drogas e medicina regenerativa. Atualmente, vários mé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor