Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

Resumo

Apresentamos uma nova abordagem para microscopia de dois fótons da liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro marcadas fluorescente para glioblastoma em um modelo de camundongo.

Resumo

A administração intravenosa de terapêutica do câncer para tumores cerebrais é limitada pela barreira hematoencefálica. Um método para obter imagens diretas do acúmulo e distribuição de macromoléculas em tumores cerebrais in vivo aumentaria muito nossa capacidade de entender e otimizar a liberação de fármacos em modelos pré-clínicos. Este protocolo descreve um método para rastreamento in vivo em tempo real de nanopartículas fluorescentes marcadas por via intravenosa com microscopia intravital de dois fótons (2P-IVM) em um modelo de glioblastoma (GBM) em camundongos.

O protocolo contém uma descrição do procedimento em várias etapas, incluindo anestesia e analgesia de animais experimentais, criação de uma janela craniana, implante de células GBM, colocação de uma barra de cabeça, realização de estudos de 2P-IVM e cuidados pós-cirúrgicos para estudos de seguimento de longo prazo. Mostramos sessões representativas de imagens 2P-IVM e análise de imagens, examinamos as vantagens e desvantagens dessa tecnologia e discutimos possíveis aplicações.

Este método pode ser facilmente modificado e adaptado para diferentes questões de pesquisa no campo da imagem cerebral pré-clínica in vivo .

Introdução

A microscopia intravital de dois fótons (2P-IVM) é uma técnica de imagem por fluorescência que permite a visualização de tecidos vivos¹.

Desenvolvida pela primeira vez na década de 1990, a 2P-IVM tem sido utilizada para análise in vivo da retina², rim³, intestino delgado⁴, cóclea⁵, coração⁶, traqueia^{7 e cérebro} em vários modelos pré-clínicos ^8,9. No campo da neurociência, a 2P-IVM tem ganhado impor....

Protocolo

O procedimento animal descrito neste protocolo está de acordo com as exigências do Painel Administrativo de Cuidados com Animais de Laboratório (APLAC).

1. Cultura celular

1. Preparação do exaustor
   1. Lave as mãos, use luvas e jaleco. Ligue o armário de segurança biológica e ajuste o nível da faixa para uma altura de abertura apropriada. Deixe o capuz purgar por 3-5 min. Borrife a área da coifa com etanol 70% e limpe-a com papel higiênico.
   2. Borrife todos os reagentes com etanol 70% e limpe com papel higiênico. Mova os reagentes para o capô. Não coloque nenhum item na grelha. Se ocorrer um derramamento n....

Discussão

Apresentamos um método para rastreamento in vivo de NP em tempo real usando 2P-IVM através de uma janela craniana para avaliar a liberação tumoral de NPs de óxido de ferro marcadas com fluorescência. A técnica cirúrgica para este procedimento requer mão firme e habilidades cirúrgicas experimentais avançadas. É aconselhável praticar o uso de carcaças ou objetos simuladores antes de avançar para a experiência com animais vivos. Como alternativa, Hoeferlin e col. implementaram uma broca robótica pa.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot