Ensaio baseado em transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) para medir interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio baseado em BRAKET para medir as interações da quinase CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. O protocolo descreve as etapas para preparar as células, ler as emissões de BRET e analisar dados. Um exemplo de resultado com identificação de controles apropriados e solução de problemas para otimização de ensaio também é apresentado.

Resumo

O CRAF é um efetor primário das GTPases RAS e desempenha um papel crítico na tumorigênese de vários cânceres causados por KRAS. Além disso, o CRAF é um hotspot para mutações germinativas, que causam a RASopatia do desenvolvimento, síndrome de Noonan. Todas as quinases RAF contêm vários locais de ligação dependentes de fosforilação para proteínas reguladoras 14-3-3. A ligação diferencial de 14-3-3 a esses locais desempenha papéis essenciais na formação de dímeros RAF ativos na membrana plasmática sob condições de sinalização e na manutenção da autoinibição do RAF em condições quiescentes. Compreender como essas interações são reguladas e como elas podem ser moduladas é fundamental para identificar novas abordagens terapêuticas que visam a função da RAF. Aqui, descrevo um ensaio baseado em transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) para medir as interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. Especificamente, este ensaio mede as interações de CRAF fundido a um doador de Nano luciferase e 14-3-3 fundido a um aceitador de tag Halo, onde a interação de RAF e 14-3-3 resulta na transferência de energia doador para aceitador e na geração do sinal BRET. O protocolo mostra ainda que esse sinal pode ser interrompido por mutações que impedem a ligação do 14-3-3 a cada um de seus locais de ancoragem de alta afinidade da RAF. Este protocolo descreve os procedimentos para semear, transfectar e replaquear as células, juntamente com instruções detalhadas para ler as emissões de CHUT, realizar análises de dados e confirmar os níveis de expressão de proteínas. Além disso, são fornecidos exemplos de resultados de ensaios, juntamente com etapas de otimização e solução de problemas.

Introdução

As quinases RAF (ARAF, BRAF e CRAF) são os efetores diretos das GTPases RAS e os membros iniciadores da cascata de quinase RAF-MEK-ERK pró-proliferativa/pró-sobrevivência. Estudos recentes mostraram que a expressão de CRAF desempenha um papel fundamental na tumorigênese de vários cânceres causados por KRAS, incluindo câncer de pulmão de células não pequenas e adenocarcinoma ductal pancreático 1,2,3,4,5. Além disso, as mutações germinativas do CRAF causam uma forma particularmente grave da RASopatia, a síndr....

Protocolo

NOTA: Este ensaio é realizado em células de 293 pés. Uma linha epitelial bem caracterizada e facilmente transfectável derivada de células renais embrionárias humanas. Uma única placa de cultura confluente de 10 cm dessas células normalmente fornece células suficientes para semear 20 poços de placas de cultura de tecidos de 6 poços. As etapas 1 a 3 devem ser executadas usando técnica estéril em uma cabine de segurança biológica.

1. Semeadura celular (dia 1)

NOTA: Nesta etapa, as células são destacadas da(s) placa(s) de cultura de tecidos, contadas e semeadas em placas de cultura de tecidos de 6 poço....

Discussão

Estudos anteriores mostraram que as proteínas 14-3-3 desempenham papéis críticos na ativação e inibição das quinases RAF. Compreender como esses eventos de ligação são regulados e os efeitos da modulação dessas interações na sinalização RAF e na oncogênese orientada por RAF pode revelar novas vulnerabilidades terapêuticas que visam a função CRAF. No entanto, o ciclo de ativação de Raf é suportado por uma infinidade de proteínas associadas, modificações pós-traducionais e mudanças na localizaç.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
HaloTag® mouse monoclonal antibody	Promega	G9211	Antibody for detecting HaloTag tagged  proteins by immunoblot
NanoLuc® mouse monoclonal antibody	R&D Systems	MAB10026	Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot
CRAF mouse monoclonal antibody (E10)	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot
ECL anti-mouse HRP secondary antibody	Amersham	NA931-1ML	Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)
Reagents
X-tremeGENE™ 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET™ kit	Promega	N1661	NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate
DPBS, without Ca++ and Mg++	Quality Biologicals	114-057-101
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Life Technologies	25300120
DMEM cell culture media	Life Technologies	11995073	High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030164
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140163
Opti-MEM™ I reduced serum media	Gibco	31985062	For cell transfection
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red	Gibco	11058021	For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).
Invitrogen Trypan Blue Stain	Thermo Scientific	T10282
NP40 lysis buffer	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,  NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.
5x gel sample buffer	N/A	N/A	240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.
Cell lines
293FT cells (human)	Thermo Scientific	R70007
DNA vectors
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Multimode Plate Reader	PerkinElmer 2104	2104-0010	600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,  Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip™  Multichannel  Pipettor	Thermo Scientific	4672070
Software
GraphPad Prism (version 10.0.3)	GraphPad	www.graphpad.com
Other
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips	Thermo Scientific	94410153
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™	PerkinElmer	6007680	White, polystyrene, tissue culture treated
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Scientific	C10228