Separação Rápida e Exibição de Agentes Fibrinogenolíticos Ativos em Sipunculus nudus por meio de Eletroforese em Gel de Fibrinogênio-Poliacrilamida

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroforese em gel de fibrinogênio-poliacrilamida (PAGE) para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Resumo

Agentes fibrinogenolíticos que podem dissolver o fibrinogênio diretamente têm sido amplamente utilizados no tratamento anticoagulante. Geralmente, a identificação de novos agentes fibrinogenolíticos requer a separação de cada componente primeiro e, em seguida, a verificação de suas atividades fibrinogenolíticas. Atualmente, a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a cromatografia são usadas principalmente na etapa de separação. Enquanto isso, o ensaio em placa de fibrinogênio e produtos de reação baseados em PAGE são geralmente adotados para exibir suas atividades fibrinogenolíticas. No entanto, devido à separação espaço-temporal desses dois estágios, é impossível separar e exibir os agentes fibrinogenolíticos ativos com o mesmo gel. Para simplificar os processos de separação e exibição da identificação do agente fibrinogenolítico, construímos um novo método fibrinogênio-PAGE para separar e exibir rapidamente os agentes fibrinogenolíticos de vermes do amendoim (Sipunculus nudus) neste estudo. Este método inclui preparação de fibrinogênio-PAGE, eletroforese, renaturação, incubação, coloração e descoloração. A atividade fibrinogenolítica e o peso molecular da proteína podem ser detectados simultaneamente. De acordo com este método, detectamos com sucesso mais de um agente fibrinogenolítico ativo de sem-fim de amendoim em 6 h. Além disso, este método de fibrinogênio-PAGE é demorado e econômico. Além disso, este método pode ser usado para estudar os agentes fibrinogenolíticos dos outros organismos.

Introdução

Nos últimos anos, devido ao aumento contínuo das doenças trombóticas, as doenças trombóticas tornaram-se um novo grande problema de saúde global¹. Atualmente, os antitrombóticos são classificados em três grupos: antiagregantes plaquetários, anticoagulantes e trombolíticos. Entre eles, drogas trombolíticas, como uroquinase (Reino Unido), ativador de plasminogênio tecidual (tPA), etc., são as únicas drogas clinicamente usadas que podem hidrolisar o trombo². Enquanto isso, drogas trombolíticas mais seguras e eficazes estão sendo desenvolvidas pela identificação de novos agentes trombolítico....

Protocolo

1. Preparação do homogeneizado do sem-fim do amendoim

1. Adicione 50 g de vermes de amendoim e 150 mL de solução salina no homogeneizador.
2. Homogeneizar a 24000 rpm por 60 s.
   NOTA: Repita 3 vezes.
3. Centrifugar o homogenato a 9710 x g durante 30 min a 4 °C.
4. Colete o sobrenadante como homogeneizado do verme do amendoim para um estudo mais aprofundado.

2. Preparação do gel Fibrinogen-PAGE

1. Pesar 0,01 g de fibrinogênio em um copo de vidro de 50 mL.
2. Adicione 1,9 mL de DDH₂O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,....

Discussão

sFE é uma nova enzima fibrino(geno)lítica isolada de vermes de amendoim por nossa equipe anteriormente 3,6,8,13. No entanto, os processos de identificação da sFE foram demorados e trabalhosos, envolvendo as etapas de detecção da atividade fibrinogenolítica, separação dos componentes proteicos e confirmação da atividade. Como um método simples, o ens.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200