13C6-Marcação de glicose associada a LC-MS: Identificação de órgãos primários de plantas na síntese de metabólitos secundários

Resumo

O método desenvolvido de marcação com ¹³C_6-glicose combinado com espectrometria de massa de alta resolução por cromatografia líquida é versátil e estabelece as bases para estudos futuros sobre os órgãos e vias primárias envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais, bem como a utilização abrangente desses metabólitos secundários.

Resumo

Este trabalho apresenta um método novo e eficiente para certificar órgãos primários envolvidos na síntese de metabólitos secundários. Como o metabólito secundário mais importante em Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mão. -Mzt. (PPY), a saponina de Paris (PS) tem uma variedade de atividades farmacológicas e o PPY está em demanda crescente. Este estudo estabeleceu quatro tratamentos com folhas, rizoma e feixes vasculares do caule ¹³C_6-Glicose alimentando e não alimentando para certificar com precisão os órgãos primários envolvidos na síntese de saponinas Paris VII (PS VII). Ao combinar cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), as razões ¹³C/¹²C de folha, rizoma, caule e raiz em diferentes tratamentos foram calculadas com rapidez e precisão, e quatro tipos de razões de pico de íons isotópicos PS (M⁻) foram encontrados: (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ e (M+4) ⁻/M⁻. Os resultados mostraram que a relação de ¹³C/¹²C nos rizomas dos tratamentos caule-vascular-feixe e alimentação do rizoma foi significativamente maior do que no tratamento não alimentar. Em comparação com o tratamento não alimentar, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nas folhas aumentou significativamente sob os tratamentos de alimentação com feixe vascular foliar e caule. Simultaneamente, em comparação com o tratamento não alimentar, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ nas folhas sob tratamento com rizoma não apresentou diferença significativa. Além disso, a proporção de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ no caule, raiz e risoma não mostrou diferenças entre os quatro tratamentos. Em comparação com o tratamento não alimentar, a razão da molécula de saponina Paris II (PS II) (M+2) ⁻/M⁻ nas folhas sob tratamento de alimentação foliar não mostrou diferença significativa, e a razão (M+3) ⁻/M⁻ das moléculas de PS II nas folhas sob tratamento de alimentação foliar foi menor. Os dados confirmaram que o órgão primário para a síntese do PS VII são as folhas. Ele estabelece as bases para a futura identificação dos órgãos e vias primárias envolvidos na síntese de metabólitos secundários em plantas medicinais.

Introdução

As vias biossintéticas dos metabólitos secundários nas plantas são intrincadas e diversas, envolvendo órgãos de acumulação altamente específicos e diversos¹. Atualmente, os locais de síntese específicos e os órgãos responsáveis pelos metabólitos secundários em muitas plantas medicinais não estão bem definidos. Essa ambigüidade representa um obstáculo significativo para o avanço estratégico e a implementação de métodos de cultivo projetados para otimizar o rendimento e a qualidade dos materiais medicinais.

Técnicas de biologia molecular, bioquímica e marcação de isótopos são amplamente empregadas para desvendar as via....

Protocolo

1. Preparação experimental

1. Certifique-se de que, durante o crescimento das plantas, a umidade relativa da estufa seja de 75%, as temperaturas dia/noite sejam de 20 °C/10 °C, o fotoperíodo seja composto de 12 h de dia e 12 h de noite e a intensidade da luz seja de 100 μmol·^m-2·^s-1. Forneça irradiância por meio de lâmpadas de diodo emissor de luz (LED), mantendo uma distância de 30 cm entre a lâmpada LED e a copa da planta.
   NOTA: O fotoperíodo e a intensidade da luz estão de acordo com o número de horas de sol durante o período de crescimento em Yunnan. A irradiância é medida rotineiramente por um sensor quântico (cons....

Discussão

A implementação bem-sucedida deste protocolo depende de pesquisas abrangentes sobre propriedades fisiológicas de plantas, tecidos, órgãos e metabólitos secundários. A abordagem de design experimental descrita no protocolo estabelece uma base robusta para investigar as vias biossintéticas dos metabólitos secundários das plantas. Os fatores críticos neste experimento são (1) determinar a idade das mudas perenes e (2) escolher o tempo correto de detecção de marcação de isótopos. As plantas medicinais são c.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2