Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

Resumo

Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

Resumo

A resposta imune adaptativa depende da capacidade de uma célula T de migrar através do sangue, linfa e tecido em resposta a patógenos e corpos estranhos. A migração de células T é um processo complexo que requer a coordenação de muitas entradas de sinal do ambiente e das células imunes locais, incluindo quimiocinas, receptores de quimiocinas e moléculas de adesão. Além disso, a motilidade das células T é influenciada por pistas ambientais dinâmicas circundantes, que podem alterar o estado de ativação, a paisagem transcricional, a expressão da molécula de adesão e muito mais. In vivo, a complexidade desses fatores aparentemente entrelaçados torna difícil distinguir sinais individuais que contribuem para a migração de células T. Este protocolo fornece uma série de métodos, desde o isolamento de células T até a análise auxiliada por computador para avaliar a migração de células T em tempo real sob condições ambientais altamente específicas. Essas condições podem ajudar a elucidar os mecanismos que regulam a migração, melhorando nossa compreensão da cinética das células T e fornecendo fortes evidências mecanicistas que são difíceis de obter por meio de experimentos com animais. Uma compreensão mais profunda das interações moleculares que afetam a migração celular é importante para desenvolver uma terapêutica aprimorada.

Introdução

As células T são os principais efetores da resposta imune adaptativa e específica do antígeno. Em nível populacional, as células T são heterogêneas, compostas por subconjuntos celulares com funções especializadas distintas. É importante ressaltar que as células T CD8+ são os principais efetores citolíticos do sistema imunológico, que eliminam diretamente as células infectadas ou disfuncionais¹.

As células T CD8+ maduras residem no tecido e circulam pelo sangue e linfáticos em busca de antígenos. Durante a infecção, as células T são apresentadas a antígenos no sangue ou tecido e drenam rapidamente para o baço ou linfo....

Protocolo

Os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Universitário de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos neste estudo foram mantidos no espaço livre de patógenos do biotério da Universidade de Rochester. Camundongos C57BL/6 machos/fêmeas, com idade entre 6 e 12 semanas (15-30 g), foram usados para o presente estudo. O isolamento do tecido do camundongo pode ser realizado em uma bancada com luvas para cobrir as mãos e uma máscara facial para cobrir o nariz e a boca, ou dentro de um gabinete de biossegurança. Toda a cultura celular e preparação da placa devem ser realizadas em uma cabine de biossegurança. Os reagentes e equipamentos utilizados ne....

Discussão

Compreender o impacto biológico dos sinais convergentes in vivo é desafiador e não é fácil de interpretar. Os protocolos aqui apresentados fornecem um método razoável para entender a migração de células T em condições altamente definidas e biologicamente relevantes. Essas condições podem ser especificadas com base no critério do investigador, e os protocolos podem ser modificados para atender às necessidades de várias populações de células T, status de ativação e fenótipo celular. Além di.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software