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Summary

A microdureza é uma propriedade mecânica e um parâmetro informativo para avaliar a fisiopatologia do tecido duro. Aqui, demonstramos um protocolo padronizado (preparação de amostras, polimento, superfície plana e locais de indentação) para análise de microdureza em dente e osso alveolar em modelos de doença bucal de roedores, ou seja, fluorose dentária e reabsorção óssea periodontal induzida por ligadura.

Abstract

A propriedade mecânica, microdureza, é avaliada no esmalte dentário, dentina e osso em modelos de doenças bucais, incluindo fluorose dentária e periodontite. A micro-CT (μCT) fornece informações de imagem 3D (volume e densidade mineral) e a microscopia eletrônica de varredura (MEV) produz imagens de microestrutura (prisma de esmalte e lacuna-canalicular óssea). Complementarmente à análise estrutural por μCT e MEV, a microdureza é um dos parâmetros informativos para avaliar como as mudanças estruturais alteram as propriedades mecânicas. Apesar de ser um parâmetro útil, os estudos sobre a microdureza do osso alveolar em doenças bucais são limitados. Até o momento, métodos divergentes de medição de microdureza foram relatados. Como os valores de microdureza variam dependendo da preparação da amostra (polimento e superfície plana) e dos locais de indentação, diversos protocolos podem causar discrepâncias entre os estudos. A padronização do protocolo de microdureza é essencial para uma avaliação consistente e precisa em modelos de doenças bucais. No presente estudo, demonstramos um protocolo padronizado para análise de microdureza em dente e osso alveolar. Os espécimes utilizados são os seguintes: para o modelo de fluorose dentária, os incisivos foram coletados de camundongos tratados com/sem água contendo flúor por 6 semanas; para o modelo de reabsorção óssea periodontal induzida por ligadura (L-PBR), ossos alveolares com reabsorção óssea periodontal foram coletados de camundongos ligados no2º molar superior. Com 2 semanas após a ligadura, a maxila foi coletada. A dureza Vickers foi analisada nesses corpos de prova de acordo com o protocolo padronizado. O protocolo fornece materiais e métodos detalhados para incorporação de resina, polimento em série e locais de indentação para incisivos e alveolares. Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo de microdureza padronizado para avaliar as propriedades mecânicas do dente e do osso alveolar em modelos de doenças bucais de roedores.

Introduction

A dureza é uma das propriedades mecânicas (por exemplo, elasticidade, dureza, viscoelasticidade e comportamento de fratura) e é comumente usada para caracterizar a capacidade de resistir à deformação por compressão e fratura de uma área local de um material. O teste de dureza de indentação estática é o método mais utilizado, incluindo dureza Vickers e dureza Knoop1. O teste de dureza Vickers é implementado pressionando um penetrador de diamante na superfície sob uma carga de teste fixa. O penetrador é em forma de pirâmide, com uma base quadrada e um ângulo de 136° entre faces opostas. O comprimento de ambas as diagonais formadas na superfície de teste é medido e a média é usada para calcular a dureza, que é determinada pela razão F / A (onde F é a força e A é a área da superfície do recuo). O número de microdureza Vickers (HV=F/A) é geralmente expresso em quilogramas-força (kgf) por mm2 de recuo, com 1 HV ≈ 0,1891 F/d2 (N/mm2). A dureza Knoop também consiste em um penetrador de pirâmide quadrada de diamante formado por dois ângulos opostos desiguais. O número de dureza Knoop (HK) é igual à razão entre a carga aplicada e a área de contato projetada. Os testes de dureza são classificados em testes de micro-indentação (microdureza) e testes de macro-indentação, dependendo da força aplicada ao material de teste. Os testes de microindentação normalmente usam cargas na faixa de 0,01-2 N (cerca de 1-203 gf); enquanto isso, os testes de macroindentação usam mais de 10 N (10119 gf)1.

Para avaliar as características dos tecidos duros dentários em doenças bucais, incluindo dente e osso alveolar, micro-CT (μCT) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) são usadas para análise estrutural. μCT fornece informações de imagem 3D (volume e densidade mineral)2, e SEM produz imagens de microestrutura (prisma de esmalte e lacuna-canalicular óssea)3. Complementarmente à análise estrutural por μCT e MEV, a microdureza é um dos parâmetros informativos para avaliar como as mudanças estruturais alteram as propriedades mecânicas do osso dentário e alveolar em doenças bucais, por exemplo, malformação do esmalte e reabsorção óssea periodontal. O valor de microdureza Vickers do esmalte humano (HV = 283-374) é cerca de 4 a 5 vezes maior do que o da dentina (HV = 53-63)4,5. Em modelos de fluorose dentária de roedores, a microdureza do esmalte diminui significativamente em incisivos de camundongos tratados com flúor (HV = 136) em comparação com o esmalte controle (HV = 334)6,7. Isso sugere que o esmalte fluorado é mais macio e mais fraco, com menor teor de minerais e maior teor de proteína do que o encontrado no esmalte não fluorosado. A microdureza é usada para avaliar as propriedades mecânicas ósseas. Vários estudos anteriores examinaram o comportamento mecânico do osso humano em diferentes sítios anatômicos, incluindo microdureza de ossos longos 8,9,10. A microdureza média dos fêmures fluorados humanos apresentou uma diminuição significativa (HV = 222,4) em comparação com os fêmures não fluorosados (HV = 294,4)11. Apesar de ser um parâmetro útil, há escassez de literatura descrevendo a microdureza (Vickers12 ou Knoop 13,14) do osso alveolar em doenças bucais.

Até o momento, métodos divergentes de medição de microdureza foram relatados. Como os valores de microdureza variam15 dependendo da preparação da amostra (polimento e superfície plana) e do local de indentação, diversos protocolos podem causar discrepâncias entre os estudos. A padronização do protocolo de teste de microdureza é essencial para uma avaliação consistente e precisa em modelos de doenças bucais. No presente estudo, demonstramos um protocolo padronizado para análise de microdureza em dente e osso alveolar em modelo de fluorose dentária de camundongo e modelo de reabsorção óssea periodontal.

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Protocol

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados aprovados pelo Comitê Institucional de Uso de Cuidados com Animais (IACUC) da Augusta University e da Nova Southeastern University, que é credenciado pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Observe que o Dr. Suzuki foi contratado pela Universidade de Augusta, onde os experimentos de fluorose dentária de camundongos foram concluídos.

1. Extração de incisivos inferiores em modelo de fluorose dentária de camundongo

  1. Alimente camundongos C57BL/6 com dietas sem flúor (5 semanas de idade, machos) de 1 semana antes do flúor até o término do tratamento com flúor.
  2. Prepare a água com flúor adicionando NaF em água destilada seguida de filtração a vácuo usando um filtro de 0,2 μm. Dê aos animais água com flúor como NaF (0 ppm e 125 ppm; N=5/grupo) ad libitum por 6 semanas. Substitua a água com flúor por um lote recém-preparado a cada 2 dias.
  3. Após 6 semanas de tratamento com água com flúor, eutanasiar animais com CO2 seguido de decapitação.
  4. Extraia o hemi mandibular com incisivo de cada camundongo. Para coletar o hemi mandibular com incisivo, corte os músculos ao redor da mandíbula mandibular sem aplicar força excessiva.
  5. Coloque o hemimandibular em PBS e mantenha-o a 4 °C até a análise de μ-TC (opcional). Separe o incisivo do mandibular usando um bisturi (# 15) e uma tesoura sem danificar ou quebrar a amostra.
  6. Lave o incisivo isolado com PBS e realize a desidratação imergindo-o em álcool crescente (etanol 70% e 100%) por 2-3 h.
    NOTA: Se o tecido (por exemplo, polpa) não estiver suficientemente desidratado, é provável que a impregnação de resina seja inibida e a avaliação subsequente provavelmente será inadequada.
  7. Após a desidratação com etanol, embutir o incisivo horizontalmente em resina. Continue para a etapa 3.

2. Extração de ossos alveolares superiores em um modelo de reabsorção óssea periodontal induzida por ligadura de camundongo (L-PBR)

  1. Administre 0,8 mL de cetamina (100 mg / mL) + 0,1 mL de xilazina (100 mg / mL) + 9,1 mL de PBS por via intraperitoneal (i.p.) para camundongo (C57BL / 6, 8-12 semanas de idade, macho) como anestésicos. A dosagem é de 0,01 mL / g (peso). Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento sob anestesia.
  2. Coloque o mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento por 5-10 min. Avalie as respostas aos beliscões da cauda/dedo do pé e a integridade do reflexo ocular. Confirme se o mouse não responde aos estímulos nocivos e se o reflexo está ausente.
  3. Coloque o mouse na mesa de tratamento e mantenha a boca aberta por meio de uma sutura de seda ligadura 5-0 amarrada a um poste magnético na mesa de tratamento.
  4. Sob um microscópio cirúrgico, enrole a ligadura (sutura de seda trançada 6-0) em torno de um lado do segundo molar superior (camada única) usando porta-agulhas. Minimize as diferenças individuais na análise usando um lado como o lado do tratamento e o outro lado como o controle.
  5. Amarre a ligadura e dê um nó no lado do palato. Depois de dar um nó, corte a ligadura restante o mais curto possível para que a ligadura excessiva não interfira na mastigação ou na alimentação. Isso é importante para garantir que a ligadura não se solte ao mastigar durante o período de observação subsequente.
    NOTA: Não deixe o animal sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não devolva o animal que foi submetido a cirurgia à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Manter condições estéreis durante a sobrevivência.
  6. Alimente os ratos com dieta e água ad libitum por 2 semanas. Após 2 semanas de ligadura, eutanasiar camundongos com CO2 seguido de decapitação.
  7. Extraia ambas as maxilas laterais (lado da ligadura e lado do controle) com molares de cada camundongo. Para coletar maxilas com molares, corte os músculos e ossos ao redor da mandíbula maxilar usando uma tesoura sem aplicar força excessiva. Colocar cada maxila em PBS e mantê-la a 4 °C até à análise de μCT (facultativo).
  8. Separe o osso alveolar com molares (1ºa 3º) da maxila usando bisturi (#15) e tesoura sem danificar ou quebrar a amostra.
  9. Lave o osso alveolar isolado com PBS, depois desidrate e desengordure por imersão em álcool crescente (70% e 100% de etanol) por 2-3 h.
    NOTA: Se o tecido (por exemplo, polpa e osso) não estiver suficientemente desidratado, é provável que a impregnação da resina seja inibida e a avaliação subsequente provavelmente será inadequada.
  10. Após a desidratação com etanol, embutir o osso alveolar horizontalmente em resina. Continue para a etapa 3.
  11. Opcional: Realize a avaliação do μCT antes do teste de microdureza.
    1. Antes do teste de microdureza, realize uma análise estrutural não destrutiva (por exemplo, μCT) usando a mesma amostra para teste de microdureza como uma avaliação complementar (Figura 1). Informações estruturais (imagem 3D, densidade mineral, volume) por μCT podem ajudar a avaliar as propriedades mecânicas e a qualidade da amostra que podem afetar os resultados de microdureza.

figure-protocol-1
Figura 1: Imagens representativas de μCT do esmalte em incisivos de camundongos controlados e tratados com flúor. (A) Imagem sagital representativa de μCT do incisivo inferior. (B-D) μCT imagens coronais do incisivo controle (NaF 0 ppm). (E-G) μCT imagens coronais de incisivos tratados com NaF (125 ppm). A densidade mineral representativa do esmalte (EMD) é mostrada (g/cm3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Incorporando amostras em resina

  1. Continue a partir da etapa 1.7 (modelo de fluorose dentária) ou da etapa 2.10 (modelo L-PBR).
  2. Cubra a superfície interna do copo de montagem (1 polegada) com uma fina camada de petrolato. Misture a resina (resina de incorporação de configuração a frio) de acordo com as instruções. Despeje a resina e o endurecedor no copo plástico fornecido na proporção de 15:2 e misture cuidadosamente com uma espátula de madeira por pelo menos 2 min. Evite bolhas de ar.
  3. Coloque o incisivo desidratado e desengordurado (Figura 2A) ou o osso alveolar com os molares (Figura 2B) orientados horizontalmente e paralelos ao fundo do copo de montagem (1 amostra por copo).
  4. Despeje a resina misturada (resina suficiente, cerca de 1,5 mL) no copo de montagem para cobrir completamente a amostra. Evite adicionar mais resina do que o necessário, pois o excesso de resina impedirá o processo de polimento (Figura 2C,D). Coloque o copo de montagem contendo a amostra em uma placa quente a 50 °C por pelo menos 8 h para promover a polimerização da resina. Este procedimento contribui para manter a amostra em uma posição estável.
    NOTA: Dependendo do tamanho da amostra, ajuste a quantidade de resina para cobrir completamente a amostra. Não encha muita resina, caso contrário, será necessário mais tempo para remover a resina supérflua.
  5. Após a cura, remova a resina que contém a amostra do copo de montagem. Remova as rebarbas e organize o plano da amostra e o plano do lado oposto como paralelos e planos usando um polidor avançado com lixa áspera resistente à água (Grão 60 / P60 e 120 / P120) sob inundação de água. Mantenha a altura da amostra em aproximadamente 3 mm para o osso incisivo e alveolar (Figura 2E, F).
    NOTA: Quando a amostra é analisada por MEV após a medição da microdureza, a espessura da amostra deve ser de cerca de 3 mm para que a observação subsequente de MEV não seja afetada. Amostras menores são mais difíceis de manipular com o moedor. Para as amostras destinadas apenas à microdureza, a altura da amostra pode aumentar para cerca de 10-20 mm.
  6. Apare a forma externa para fazer um bloco retangular de resina sólida e cantos arredondados (aproximadamente, largura 30 mm, comprimento 10 mm para incisivo (Figura 2G) e largura 10 mm, comprimento 5 mm, para osso alveolar (Figura 2H)) usando uma serra de corte de precisão.
  7. Quando a correção da forma aproximada estiver concluída, remova os detritos e partículas do bloco de resina usando um limpador ultrassônico (cerca de 1 min). Continue para a etapa 4.

figure-protocol-2
Figura 2: Fluxo do procedimento de incorporação e polimento de resina. (A) Incisivo desidratado e desengordurado. (B) Osso alveolar desidratado e desengordurado em L-PBR. (C, D) Incisivos e osso alveolar imersos em resina. (E, F) Ao cortar a resina, é mais fácil polir a superfície do tecido alvo. (G, H) Cantos de resina arredondados para o processo de polimento. Abreviaturas: L-PBR = reabsorção óssea periodontal induzida por ligadura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Polimento de amostras

NOTA: O polimento das amostras é feito manualmente usando lixas à prova d'água (de ásperas para mais finas) em um polidor avançado sob inundação de água.

  1. Coloque uma lixa áspera resistente à água (Grit 600/P1200) no moedor. Coloque o bloco de resina aparado e limpo (da etapa 3.7) na lixa áspera resistente à água.
  2. Enquanto despeja água, segure o bloco de resina e polir a superfície de avaliação da amostra no moedor-polidor (velocidade 1-10 x g). Neste momento, tenha o cuidado de segurar o bloco de resina de forma que a superfície de avaliação fique paralela ao solo. Para manter a superfície de avaliação intacta, verifique a superfície a olho nu ou sob um microscópio.
    NOTA: Observe que o moedor gira no sentido horário e a pressão uniforme pode levar a uma superfície incomparável. Para obter uma superfície paralela, mantenha a velocidade de rotação do planador constante e pressione a amostra cuidadosamente por alguns segundos e, em seguida, gire a amostra 180° para pressionar pelo mesmo período de tempo. O papel abrasivo áspero pode remover não apenas a resina, mas também a amostra.
  3. Troque a lixa para Grit 800/P2400 e coloque o bloco de resina sobre ela. Repita a etapa 4.2.
  4. Remova detritos e partículas do bloco de resina usando um limpador ultrassônico (cerca de 1 min).
    NOTA: Antes de prosseguir, recomenda-se o uso de um limpador ultrassônico para remover quaisquer detritos da superfície para evitar entupimento.
  5. Em seguida, execute o polimento em série usando papéis abrasivos mais finos; A ordem de polimento é de 12 μm, 9 μm, 3 μm, 1 μm e 0,3 μm.
  6. Coloque um filme de lapidação (12 μm) na mesa do moedor-polidor sem rotação e coloque o bloco de resina no filme de lapidação.
    NOTA: Neste experimento, a mesa do moedor é adequada para obter uma condição de superfície plana sob inundação de água. Alternativamente, um espelho plano grande (ou similar) que fornece paralelismo também pode ser usado.
  7. Sob resfriamento a água, polir cuidadosamente a superfície de avaliação da amostra no filme de lapidação com a mão. Mova a amostra verticalmente, horizontalmente e diagonalmente pelo mesmo número de segundos sob injeção de água com movimentos de 2 a 3 cm (1 polegada). Quando o procedimento de polimento for realizado corretamente, a amostra de resina grudará no filme de lapidação.
  8. Remova detritos e partículas como na etapa 4.4. Troque o papel abrasivo para o próximo tamanho de acordo com a ordem de polimento serial (de 12 μm a 0,3 μm) e coloque o bloco de resina sobre ele.
  9. Enquanto despeja água, segure o bloco de resina e polir cuidadosamente a superfície da amostra no filme de lapidação com a mão. Remova detritos e partículas como na etapa 4.4.
  10. Repita as etapas 4.5 - 4.8 para concluir o polimento final (0.3 μm). Após completar o polimento final (0,3 μm), o corpo de prova deve ter uma superfície de acabamento espelhado (Figura 3A).
  11. Limpe a superfície da amostra com etanol (100%) para desengordurar e desidratar e armazene os blocos de resina em temperatura ambiente até o teste de microdureza. Durante o armazenamento, evite umidade e poeira excessivas. Continue para a etapa 5.

5. Teste de microdureza Vickers

NOTA: O recuo de uma amostra de superfície de acabamento espelhado é feito usando um testador de microdureza. O teste é realizado com uma carga de 25 g por 10 s com uma ponta Vickers.

  1. Teste de microdureza Vickers para incisivos (modelo de fluorose dentária)
    NOTA: O esmalte pode ser dividido em três camadas de fora (lado da cavidade oral) para dentro (lado da polpa); a saber, a camada superficial, a camada intermediária e a camada profunda (junção dentina-esmalte, JDE) Neste protocolo, três camadas de esmalte são testadas.
    1. Defina a força de carga para 25 g e a duração da carga para 10 s. Coloque o bloco de resina no palco.
    2. Recuo de 6 pontos em cada camada de esmalte (superficial, média e JD) e dentina em cada região (cervical, média e ponta; Figura 3B).
    3. Meça o comprimento das duas diagonais (d1 e d2; Figura 3B) para calcular o valor de microdureza Vickers (HV; Figura 4).
  2. Ensaio de microdureza Vickers para osso alveolar (modelo L-PBR)
    1. Defina a força de carga para 25 g e a duração da carga para 10 s. Coloque o bloco de resina no palco.
    2. Recue 3-6 pontos em cada lado mesial e distal do osso alveolar da crista alveolar. Recue os ossos alveolares entre o1º e o2º molar (quadrado branco) e o2º e o3º molar.
      NOTA: Neste protocolo, 6 pontos em cada lado mesial e distal (total de 12 pontos) foram avaliados para o osso controle (íntegro) e 3 pontos em cada lado (total de 6 pontos) foram avaliados para L-PBR. O número de pontos de indentação depende das condições da lesão (por exemplo, muita perda óssea limita a área de indentação).

figure-protocol-3
Figura 3: Regiões de avaliação da microdureza no incisivo inferior. (A) Amostra de superfície de acabamento espelhado contendo incisivo inferior. (B) Recuos em cada região; cervical, média e ponta (NaF 0 ppm). (C) Três camadas de esmalte; de DEJ, esmalte interno, médio e externo. Abreviaturas: D = dentina, E = esmalte, DEJ = junção do esmalte da dentina Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-4
Figura 4: Microdureza Vickers do esmalte tratado com ou sem NaF. A microdureza da dentina e três camadas de esmalte foram avaliadas em cada região, região cervical, média e da ponta. (AC) Controle e tratamento (DF) NaF (125 ppm). Os dados são apresentados como média ± DP. Diferenças significativas foram avaliadas por ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. **p < 0,005, ***p < 0,0005, ****p < 0,0001 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Results

Modelo de fluorose dentária: A Figura 1 mostra imagens representativas de μCT de incisivos em camundongos controle e tratados com flúor. No controle (Figura 1B-D), a região cervical apresentou menor densidade mineral do esmalte (EMD) de 1,188 g/cm3 (Figura 1B) em comparação com a média (1,924 g/cm3) e ponta (1,819 g/cm3; Figura 1C,D

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Discussion

A microdureza é realizada para avaliar as propriedades mecânicas de tecidos duros como dente e osso. Até o momento, métodos divergentes de medição de microdureza foram relatados. A maioria das informações de medição, especialmente as preparações de amostras e os locais de indentação, provavelmente são insuficientes. Este estudo teve como foco o protocolo de microdureza para esmalte e osso alveolar em modelos de fluorose dentária e doenças periodontais. Para obter resultados consistentes e precisos, as et...

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Acknowledgements

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pela JSPS KAKENHI JP21K09915 (MO) e pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais; T34GM145509 (MM) e o Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial; R01DE025255 e R21DE032156 (XH); R01DE029709, R21DE028715 e R15DE027851 (TK); R01DE027648 e K02DE029531 (MS).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Braided Silk Suture 6-0Teleflex
Canica Small Animal Surgery SystemKent Scientific Corporation SURGI 5001
CarbiMet PSA 120/P120Buehler30080120
CarbiMet PSA 60/P60Buehler36080060
CarbiMet PSA 600/P1200Buehler36080600
Castroviejo Micro Needle hilderF.S.T12060-01
Epofix cold setting embeding ResinElectron Microscopey ScienceCAT-1237
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic CleanerFisher BrandFB11201
Fluoride-free Rodent dietBio ServF1515 AIN-76A, 1/2" Pellets
in-vivo microCT Skyscan 1176Bruker
Isomet 1000 Precison sawBuehlerMA112180
Lapping film 0.3µmMaruto instrument co, LTD. Japan26-4203Alternative 
A3-0.3 SHT, 3M USA
Lapping film 1µmMaruto instrument co, LTD. Japan26-4206Alternative
A3-1 SHT, 3M USA
Lapping film 12µmMaruto instrument co, LTD. Japan26-4211Alternative
A3-12 SHT, 3M USA
Lapping film 3µmMaruto instrument co, LTD. Japan26-4204Alternative
A3-3 SHT, 3M USA
Lapping film 9µmMaruto instrument co, LTD. Japan26-4201Alternative
A3-9 SHT, 3M USA
Leica wild microscope LeicaLEIC M690
Metaserv 2000 Variable speed Grinder polisherBuehlerNo: 557-MG1-1160
MicroCut PSA 1200/P2500Buehler36081200
MicroCut PSA P4000Buehler36084000
Microhardness tester, ALPHA-MHT-1000Z PACE Technologies
SamplKups  1 inchBuehlerNo: 209178
Sodium FluorideFisher ScientificS299-100
West cott Stitch ScissorJEDMEDCat. #25-1180
ZooMed Repti Thern Undertank heater (U.T.H)Zoo Med Laboratories, Inc.RH-4

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