Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

Resumo

Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.

Resumo

As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) podem promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos. Pesquisas recentes sugerem que sua função regenerativa pode ser atribuída ao contato célula-célula e aos efeitos parácrinos celulares. O efeito parácrino é uma forma importante de as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, nas quais as vesículas extracelulares (EVs) desempenham um papel funcional como transportadoras. Existe um potencial significativo para ADSC EVs em medicina regenerativa. Vários estudos relataram a eficácia desses métodos. Vários métodos para extrair e isolar EVs são atualmente descritos com base em princípios como centrifugação, precipitação, tamanho molecular, afinidade e microfluídica. A ultracentrifugação é considerada o padrão-ouro para isolar EVs. No entanto, ainda não existe um protocolo meticuloso para destacar as precauções durante a ultracentrifugação. Este estudo apresenta a metodologia e as etapas cruciais envolvidas na cultura de ADSC, coleta de sobrenadante e ultracentrifugação EV. No entanto, embora a ultracentrifugação seja econômica e não exija tratamento adicional, ainda existem algumas desvantagens inevitáveis, como baixa taxa de recuperação e agregação de EV.

Introdução

A maioria das ADSCs é derivada do tecido adiposo e demonstrou promover a regeneração e reconstrução de vários tecidos e órgãos, incluindo miocárdio, osso e pele¹. Pesquisas recentes sugerem que a função regenerativa das ADSCs pode ser devida ao contato intercelular e aos efeitos parácrinos das células². O efeito parácrino é um meio importante para as células interagirem e transferirem informações em curtas distâncias, e essa função é alcançada por meio de vesículas extracelulares (EVs).

Os EVs são estruturas de membrana de camada dupla produzidas pelas células, com um diâmetro variando de 40 n....

Protocolo

A visão geral das etapas do protocolo é mostrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia

1. Prepare um meio de cultura para ADSC sem exossomos usando 450 mL de meio de cultura basal, 50 mL de soro fetal bovino sem exossomos e 5 mL de antibióticos triplos.

2. Ressuscitação e cultura de ADSCs

NOTA: Ressuscite ADSCs.

1. Ligue a radiação UV da mesa ultralimpa com antecedência e desinfete-a por 30 mi....

Discussão

Durante o processo experimental formal, vários pontos são cruciais para alcançar os melhores resultados experimentais. Com base em nossa experiência anterior, recomenda-se optar pela passagem 3-6 ADSCs, pois garantem o melhor estado celular possível. Antes do P3, os glóbulos vermelhos, as células endoteliais e outras células diversas podem não ter sido excluídos. Após P6, as células podem envelhecer gradualmente, o que pode afetar o estado dos EVs secretados. Em segundo lugar, o sobrenadante deve ser coletado.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410