Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Resumo

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Resumo

Várias técnicas para isolar a medula óssea de camundongos adultos foram bem estabelecidas. No entanto, isolar a medula óssea de camundongos neonatais é desafiador e demorado, mas para alguns modelos, é translacionalmente relevante e necessário. Este protocolo descreve um método eficiente e direto para preparar células da medula óssea de filhotes de 7 a 9 dias de idade. Essas células podem então ser isoladas ou diferenciadas em tipos específicos de células de interesse. Os macrófagos são células imunológicas cruciais que desempenham um papel importante na inflamação e infecção. Durante o desenvolvimento, os macrófagos neonatais contribuem significativamente para a remodelação tecidual. Além disso, o fenótipo e as funções dos macrófagos neonatais diferem daqueles de seus homólogos adultos. Este protocolo também descreve a diferenciação de macrófagos neonatais das células isoladas da medula óssea na presença de meio condicionado por L929. Marcadores de superfície para macrófagos neonatais diferenciados foram avaliados por meio de análise por citometria de fluxo. Para demonstrar a funcionalidade, a eficiência fagocítica também foi testada usando Escherichia coli conjugada com corante sensível ao pH.

Introdução

A medula óssea envolve populações de células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais que são auto-renováveis e podem ser diferenciadas em várias linhagens celulares. As células-tronco hematopoiéticas na medula óssea dão origem a linhagens mieloides e linfóides¹. As células-tronco mesenquimais produzem osteoblastos (osso), adipócitos (gordura) ou condrócitos (cartilagem)². Essas células têm múltiplas aplicações no campo da biologia celular e engenharia de tecidos, incluindo terapia gênica ^3,4. As células progenitoras presentes na medula óssea s....

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Virgínia Ocidental e foram realizados seguindo as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa. Filhotes de camundongos C57BL/6J foram usados para este estudo. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia

1. Prepare 3 mL de meio de cultura MEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 μg / mL) em um tub....

Discussão

Pesquisas envolvendo modelos de camundongos neonatais podem apresentar uma série de desafios. Os neonatos têm um sistema imunológico em desenvolvimento que é único em comparação com os adultos⁸. Como tal, os dados gerados a partir de modelos animais adultos não devem ser considerados aplicáveis a recém-nascidos, e vários trabalhos publicados articularam bem essa ideia^18,19. Portanto, modelos específicos para neonatais e fontes .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal