Acessando o cérebro suíno por meio de craniectomia com broca pneumática de alta velocidade

Resumo

Este protocolo descreve a realização de uma craniectomia usando uma broca pneumática de alta velocidade em um porco dinamarquês Landrace de 3 meses. O acesso é feito através do osso frontal e revela a dura-máter ventral e os hemisférios cerebrais subjacentes. Este procedimento permite o acesso a uma grande parte do cérebro do porco.

Resumo

O uso de porcos como modelo animal experimental é especialmente relevante na pesquisa em neurociência, pois os sistemas nervoso central (SNC) suíno e humano compartilham muitas propriedades funcionais e arquitetônicas importantes. Consequentemente, espera-se que os suínos tenham um papel cada vez mais importante em pesquisas futuras sobre várias doenças neurológicas. Aqui, é descrito um método para realizar uma craniectomia anterior através do osso frontal suíno. Após uma incisão na linha média e subsequente exposição do osso frontal suíno, pontos anatômicos são usados para garantir a localização ideal da craniectomia. Por meio do afinamento cuidadoso e gradual do osso frontal com uma broca arredondada, é alcançada uma abertura retangular para a dura-máter e os hemisférios cerebrais subjacentes. O método apresentado requer certos materiais cirúrgicos, incluindo uma broca pneumática de alta velocidade e algum grau de experiência cirúrgica. As complicações potenciais incluem lesões não intencionais da dura-máter ou do seio sagital dorsal. No entanto, o método é simples, eficiente em termos de tempo e oferece um alto grau de reprodutibilidade para os pesquisadores. Se executada corretamente, a técnica expõe uma grande parte do cérebro de porco não afetado para vários neuromonitoramento ou análises.

Introdução

Em geral, os modelos animais são usados quando limitações práticas e/ou éticas proíbem o uso de pacientes humanos para examinar doenças ou testar métodos cirúrgicos. Novos modelos animais são geralmente estabelecidos para fornecer novos conhecimentos com valor translacional para as condições humanas. Os roedores são frequentemente utilizados devido a considerações práticas e financeiras, mas têm valor translacional limitado para os seres humanos, especialmente devido a diferenças anatômicas substanciais¹. Os porcos, no entanto, oferecem várias vantagens em comparação com os roedores. Não apenas os porcos compartilham várias características anatômicas, fisiológicas, metabólicas e genéticas importantes com os humanos, mas o tamanho dos sistemas de órgãos suínos pode ser compatível com o peso para se assemelhar aos órgãos humanos ^2,3. Isso dá aos porcos um papel único entre os modelos animais cirúrgicos e no treinamento de procedimentos⁴. Embora o uso de modelos suínos exija certas capacidades práticas e financeiras em comparação com o uso de roedores, os suínos oferecem uma opção financeira e eticamente mais aceitável em comparação com o uso de primatas não humanos.

O cérebro suíno é de particular interesse na pesquisa em neurociência translacional. Em primeiro lugar, a arquitetura do cérebro do porco é semelhante à do cérebro humano, pois ambos são predominantemente de substância branca e girencefálicos ^3,5,6. Em segundo lugar, o maior tamanho do cérebro em porcos em comparação com roedores permite o uso de equipamentos cirúrgicos e várias modalidades de imagem equivalentes às usadas em ambientes clínicos ^7,8. Consequentemente, vários modelos suínos têm sido amplamente utilizados na pesquisa em neurociência nas últimas décadas⁹. A maioria desses modelos de SNC suínos, no entanto, requer análise direta do tecido cerebral, que pode ser obtido de várias maneiras (por exemplo, implantação de cateteres ou eletrodos, biópsias de tecido, etc.) ¹⁰. Como a maioria dessas modalidades requer algum grau de instrumentalização e acesso direto ao cérebro, diferentes abordagens para acesso cirúrgico devem ser consideradas.

Este método envolve a realização de uma craniectomia anterior através do osso frontal em uma porca dinamarquesa Landrace sedada de 3 meses. O objetivo geral deste manuscrito é descrever um método para expor uma grande proporção do cérebro suíno ventral por meio de uma craniectomia usando uma broca pneumática de alta velocidade. O primeiro passo é colocar o assunto em uma posição adequada com a cabeça elevada. Como o crânio suíno é bem diferente do dos humanos, a segunda etapa envolve o planejamento da colocação da craniectomia usando vários pontos anatômicos. O terceiro passo é acessar a dura-máter subjacente que cobre os dois hemisférios sem danificá-la.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram realizados no Hospital Universitário de Aalborg, Dinamarca, de acordo com as leis existentes e sob a aprovação da Inspeção Dinamarquesa de Experimentos com Animais (licença nº 2020-15-0201-00401). Foram utilizados suínos domésticos, fêmeas, com aproximadamente 40 kg e 3 meses de idade. Os detalhes sobre os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Alojamento do sujeito

1. Alojar os indivíduos em grupos com ciclos claro/escuro de 12 h em canetas aprovadas por pelo menos 7 dias antes do procedimento cirúrgico para garantir a aclimatação.

2. Anestesia e monitoramento

1. Sedar o animal com uma injeção intramuscular de 2 mL / 10 kg de uma mistura contendo Tiletamina 6,25 mg / mL, Cetamina 6,25 mg / mL, Zolazepam 6,25 mg / mL, Butorfanol 1,25 mg / mL e Xilazina 6,25 mg / mL.
2. Coloque o animal em decúbito dorsal em um cobertor de aquecimento para garantir a termorregulação ideal.
3. Intubar o sujeito com um tubo tamanho 6,5⁷ e ventilá-lo mecanicamente com ar não umidificado, volume corrente de 8 mL/kg e frequência respiratória de 16-20 respirações/min de acordo com as concentrações expiratórias de CO₂ expiratório <6,0 kPa.
   NOTA: Isso também garante o posicionamento correto do tubo dentro da traqueia.
4. Mantenha a anestesia por inalação de sevoflurano a 1% a 2%.
5. Aplique pomada oftálmica cuidadosamente em ambos os olhos do sujeito para evitar o ressecamento durante a anestesia.
6. Garanta o grau de anestesia verificando os reflexos ciliares e ajustando o sevoflurano de acordo.
7. Insira um cateter vesical com um termômetro na bexiga do sujeito através da uretra para monitorar a temperatura e coletar a urina em uma bolsa de cateter.
8. Monitore os sinais vitais do animal durante todo o procedimento.
   NOTA: Os sinais vitais incluem pulso, pressão arterial contínua, temperatura e CO expirado₂.
9. Insira um cateter venoso central (bainha de 6 Fr) na veia jugular direita por punção percutânea e use-o para infusão contínua de solução salina (NaCl, 0,9%), infusão de drogas e eutanásia no final do estudo.

3. Posicionamento animal

1. Coloque o sujeito em decúbito ventral com a cabeça levantada e estabilizada com sacos de areia até que o osso frontal esteja quase horizontal para garantir o posicionamento ideal.
   NOTA: Certifique-se de que a cabeça esteja um pouco imobilizada para evitar movimentos indesejados.
2. Raspe o cabelo do local da cirurgia usando um aparador ou navalha.

4. Preparação do equipamento cirúrgico

1. Prepare o equipamento cirúrgico conforme listado na Tabela de Materiais.

5. Expondo o osso frontal

1. Identifique a proeminência nucal e o aspecto caudal de cada crista orbital superior (Figura 1) para definir a linha média sagital esperada.
2. Comece com uma incisão na linha média usando bisturi nº 24 para cortar a pele e a gálea aponeurótica no periósteo do osso frontal.
3. Limpe o sangue com cotonetes cirúrgicos.
4. Separe gradualmente a gálea aponeurótica do osso frontal subjacente ao redor da incisão usando um rongeur achatado de 12 mm.
5. Use um afastador cirúrgico para separar a gálea aponeurótica e expor o osso frontal subjacente (Figura 2).

6. Identificação de marcos anatômicos do osso frontal exposto

1. Identificar a sutura sagital como referência para a linha média anatômica e a sutura coronal (Figura 2).
2. Identificar as três estruturas ósseas por meio da palpação manual: a proeminência nucal e a face caudal de ambas as cristas orbitárias superiores (Figura 1 e Figura 3).
   NOTA: Esses pontos de referência formam um triângulo dentro do qual a craniectomia é realizada (Figura 1 e Figura 4A).

7. Acesso à dura-máter

1. Usando uma broca pneumática de alta velocidade com uma broca arredondada revestida de diamante (Figura 3A), defina cada canto de um retângulo dentro das bordas do triângulo definido anteriormente.
2. Conecte cada canto com uma broca diamantada arredondada de 4 mm para garantir a localização correta da abertura (Figura 4B).
3. Dilua gradualmente o osso frontal com a broca de diamante arredondada de 4 mm até que a dura-máter fique exposta.
   NOTA: Evite fazer o primeiro ponto de contato com a dura-máter na linha média, correspondente à sutura sagital (Figura 1), pois o seio sagital dorsal grande está localizado aqui. A perfuração neste ponto pode causar hemorragia venosa significativa.
4. Use o primeiro ponto de contato com a dura-máter para avaliar visualmente a espessura do osso frontal restante.
5. Continue desbastando cuidadosamente o osso frontal no retângulo definido usando a rebarba de diamante arredondada de 4 mm.
   NOTA: Guarde o pó ósseo para hemostasia posterior de sangramento de veias ou esponjosa exposta do osso frontal.
6. Deslize um dissector de 3 mm sob o osso suficientemente diluído ao redor da placa óssea e lasque-o com uma leve pressão manual para expandir a abertura para a dura-máter.
   NOTA: Alterne entre perfurar e lascar o osso até que vários pontos da dura-máter ao redor da placa óssea sejam expostos.
7. Aplique solução salina estéril com uma seringa para limpar a visão.

8. Remoção da placa óssea

1. Insira o dissector de 3 mm sob a placa óssea e aplique uma pressão gradual para baixo em sua alça para quebrar a placa óssea.
   NOTA: A dura-máter subjacente deve agora ser exposta, revelando os contornos de ambos os hemisférios cerebrais (Figura 5 e Figura 6).
2. Avalie a integridade da dura-máter inspecionando visualmente se há vazamentos de líquido cefalorraquidiano (LCR).
   NOTA: Ambos os hemisférios se elevarão em pulsação síncrona se não houver defeitos significativos na dura-máter.
3. Pare pequenos sangramentos venosos usando poeira óssea salva ou aplicando cuidadosamente a coagulação monopolar ou bipolar com um cautério em baixa voltagem.
   NOTA: Pequenos sangramentos venosos de veias emissárias ou diplóicas são esperados.

9. Proteção da dura-máter exposta

1. Cubra a dura-máter exposta com um cotonete cirúrgico estéril embebido em solução salina estéril para evitar o ressecamento do tecido subjacente.

10. Inserção de cateteres de microdiálise (MDC)

1. Use o seio sagital dorsal como referência para a linha média. Coloque um cateter de microdiálise (MDC) dentro do lúmen de uma agulha descartável de 18 G. Penetrar a dura-máter 10 mm lateralmente a partir do seio sagital dorsal com a agulha em um ângulo de 10°-15° no sentido crânio-rostral até que 20 mm da agulha estejam dentro do tecido.
2. Retire lentamente a agulha, garantindo que o MDC permaneça no mesmo local dentro do córtex cerebral superficial.
3. Prenda firmemente o cateter à pele próxima para evitar o deslocamento do MDC.
   NOTA: Certifique-se de que a ponta do MDC não entre em contato com a ponta afiada da agulha para evitar danos.
4. Repita o procedimento usando o seio sagital dorsal como referência da linha média. Coloque um MDC dentro de uma agulha conforme descrito acima e penetre a dura-máter no hemisfério contralateral a 15 mm da linha média com a agulha perpendicular (ângulo de 90°).
   1. Insira a agulha 20 mm antes de retirá-la lentamente conforme descrito, deixando o MDC dentro do tecido cerebral subcortical. Fixe o MDC conforme descrito acima.
5. Prepare uma seringa de plástico descartável de 2 ml com uma agulha descartável de 18 G. Encha a seringa com 0,5 ml de soro fisiológico estéril.
6. Penetrar a dura-máter 20 mm lateralmente a partir da linha média, mantendo a agulha em um ângulo de 45° voltada para a linha média. Introduza lentamente a agulha 1 mm de cada vez, aspirando suavemente a cada passo da inserção.
7. Observe a seringa durante cada aspiração até que o líquido cefalorraquidiano (LCR) seja obtido.
8. Separe a agulha da seringa, mantendo a agulha no mesmo local anatômico. Insira um MDC através da agulha no ventrículo lateral até sentir resistência.
9. Prenda firmemente o MDC com fita cirúrgica conforme descrito acima.

11. Microdiálise (MD)

1. Conecte cada cateter de microdiálise (MDC) a uma bomba de microdiálise separada.
2. Inicie o processo de microdiálise bombeando solução salina estéril através do MDC e coletando-a em uma amostra adequada. Garanta o fluxo através de cada MDC observando a solução salina em cada amostra.
3. Inicie um período de calibração de tecido de 30 min de microdiálise contínua a uma taxa de fluxo de 1 μL / min.

12. Eutanásia

1. Administre um bolus de pentobarbital intravenoso (50 mg/kg) através do cateter venoso central (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente).
2. Observe as curvas de pulso, pressão arterial e CO₂ expirado no respirador para uma linha plana como confirmação de parada cardíaca.

Resultados

A posição de bruços da cabeça do porco fornece acesso ideal para o cirurgião durante o procedimento, e o uso de sacos de areia estabilizadores reduz o risco de mudanças não intencionais na posição da cabeça do porco durante a perfuração.

Durante essa demonstração, os pontos anatômicos superficiais do crânio superior do porco (cristas orbitais superiores e crista nucal) (Figura 1 e Figura 3) foram usados para identifica...

Discussão

O procedimento demonstrado envolve várias etapas críticas. Em primeiro lugar, o planejamento preciso da localização da craniectomia é crucial devido à composição do crânio suíno. Como a espessura do osso frontal suíno aumenta nas bordas laterais, colocar a abertura muito lateralmente¹¹ pode dificultar o alcance da dura-máter durante a perfuração. Além disso, localizar a abertura corretamente na linha média é importante para reduzir o risco de danos não intencionais ao seio sagita...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	303219
107 Microdialysis pump	M Dialysis	P000127	107 Microdialysis Pump
2 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	300928
25 mm, 18 G needles	Becton, Dickinson and Company	304100
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Batery for microdialysis pump	M Dialysis	8001788	Battery 6V, 106 & MD Pump
Dissector	Karl Storz	223535	Flattended 3 mm dissector
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400 mg/mL
Farabeuf Rougine	Mahr Surgical		Flat headed rougine (12 mm)
Foley Catheter 12 F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catherter with in-built thermosensor
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6 F
Microdialysis brain catheters	M Dialysis	P000050	membrane length 10 mm -shaft 100 mm 4/pkg
Microdialysis syringe	M Dialysis	8010191	106 Pump Syringe 20/pkg
Microvials for microdialysis sampling	M Dialysis	P000001	Microvials 250/pkg
Operating table
Pneumatic high-speed drill	Medtronic		Medtronic Midas Rex 7 drill
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthesia
Rounded diamond drill	Medtronic	7BA40D-MN
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia