Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Resumo

A invasão é um fenômeno biológico importante no desenvolvimento e progressão do câncer. Esse processo é influenciado por células não neoplásicas e componentes do microambiente tumoral. O objetivo deste estudo é descrever um método alternativo para análise da invasão de células tumorais in vitro usando culturas tridimensionais (3D).

Resumo

A cultura esferóide é um modelo 3D que fornece uma replicação aprimorada do microambiente in vivo em comparação com as culturas bidimensionais (2D) tradicionais. A invasão é um resultado celular de grande interesse na biologia do câncer. Neste protocolo, desenvolvemos uma estratégia alternativa para avaliar a invasão de células cancerígenas in vitro, empregando heterosferóides compostos por carcinoma espinocelular oral (CEC), fibroblastos associados ao câncer (CAF) e monócitos. Esses heterosferóides visam imitar o microambiente tumoral (TME), incluindo dois tipos de células não neoplásicas relevantes ao lado das células cancerígenas. Cada tipo de célula foi marcado com marcadores fluorescentes vitais emitidos em comprimentos de onda distintos antes da formação do esferoide. Uma vez formados, os heterosferóides foram semeados em uma camada de matriz extracelular derivada do leiomioma humano no compartimento superior de uma membrana microporosa. A invasão foi avaliada no eixo z por meio de microscopia confocal. As imagens digitais foram obtidas nos canais fluorescentes correspondentes em intervalos de 10 μm, cobrindo uma profundidade de 90 μm no eixo z. A análise foi realizada usando software de imagem freeware, calculando a intensidade de fluorescência integrada em cada imagem e canal de fluorescência. Essa abordagem permite uma análise mais dinâmica dos padrões de invasão celular em um contexto multicamadas, bem como o exame da co-localização espacial de diferentes tipos de células durante a invasão.

Introdução

A invasão é um processo no qual as células neoplásicas migram através da matriz extracelular para o tecido circundante ^1,2. À medida que o tumor progride, as células neoplásicas são expostas a microambientes cada vez mais complexos. O microambiente tumoral inclui vários componentes da matriz extracelular e tipos de células não neoplásicas. As células estromais, incluindo fibroblastos e macrófagos residentes, remodelam o microambiente secretando componentes da matriz extracelular e fatores de crescimento e citocinas, que por sua vez influenciam as funções das células neoplásicas³. As cél....

Protocolo

O uso de células humanas primárias foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Instituição (CAAE 57895822.0.0000.5416) da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de células para cultura de células 3D

NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser executadas dentro de uma capela de fluxo laminar.

1. Obtenha suspensões unicelulares das células que formarão o heterosferóide.
   NOTA: Neste experimento, geramos esferóides (ver etapa 2)....

Resultados

Este estudo apresenta um método alternativo para avaliar a invasão celular in vitro utilizando esferoides compostos por diferentes tipos celulares. Ele permite a análise dos padrões de invasão celular em um contexto multicamadas e o exame da dinâmica de co-localização celular durante a invasão (Figura 1).

As imagens de campo claro representam a localização de esferóides/células, identificadas por aglomerados escuros/pretos (

Discussão

As culturas de esferóides tridimensionais são uma abordagem poderosa para investigar vários aspectos da biologia celular. Neste estudo, relatamos um protocolo para avaliação da invasão de células neoplásicas usando heterosferóides que mimetizam o microambiente tumoral em uma abordagem multicamadas e mais dinâmica. Este método permite a avaliação da co-localização e padrões de invasão na presença de células estromais não neoplásicas.

Existem algumas etapas críticas que mer.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software