Desenvolvimento e aplicação de tirosina fosfatases reguladas por rapamicina

Resumo

Este protocolo descreve o projeto, a criação e a aplicação de fosfatases reguladas por rapamicina. Este método fornece alta especificidade e controle temporal rígido da ativação da fosfatase em células vivas.

Resumo

As tirosina fosfatases são uma importante família de enzimas que regulam funções fisiológicas críticas. Eles são frequentemente desregulados em doenças humanas, tornando-os alvos importantes de estudos biológicos. Ferramentas que permitem a regulação da atividade da fosfatase são fundamentais na dissecação de sua função. As abordagens tradicionais, como a superexpressão de mutantes negativos constitutivamente ativos ou dominantes, ou a regulação negativa usando siRNA, carecem de controle temporal. Os inibidores da fosfatase geralmente têm baixa especificidade e só permitem que os pesquisadores determinem quais processos são afetados pela inibição da fosfatase.

Desenvolvemos uma abordagem quimiogenética, o sistema regulado por rapamicina (RapR), que permite a regulação alostérica de um domínio catalítico da fosfatase que permite um controle temporal rígido da ativação da fosfatase. O sistema RapR consiste em um domínio iFKBP inserido em um sítio alostérico na fosfatase. A dinâmica estrutural intrínseca do domínio RapR interrompe o domínio catalítico, levando à inativação da enzima. A adição de rapamicina medeia a formação de um complexo entre iFKBP e uma proteína FRB co-expressa, que estabiliza iFKBP e restaura a atividade do domínio catalítico da fosfatase.

Este sistema fornece alta especificidade e controle temporal rígido da ativação da fosfatase em células vivas. Os recursos exclusivos deste sistema permitem a identificação de eventos transitórios e a interrogação de vias de sinalização individuais a jusante de uma fosfatase. Este protocolo descreve diretrizes para o desenvolvimento de uma RapR-fosfatase, sua caracterização bioquímica e a análise de seus efeitos na sinalização a jusante e na regulação da morfodinâmica celular. Ele também fornece uma descrição detalhada de uma estratégia de engenharia de proteínas, ensaios in vitro que analisam a atividade da fosfatase e experimentos de imagem de células vivas que identificam alterações na morfologia celular.

Introdução

As proteínas tirosina fosfatases são uma família crítica de proteínas envolvidas em uma infinidade de eventos de sinalização celular. Eles demonstraram desempenhar um papel fundamental na regulação da proliferação, migração e apoptose celular ^1,2,3. Consequentemente, a desregulação das proteínas tirosina fosfatases leva a uma variedade de doenças e distúrbios debilitantes 4,5,6,7. O estudo da função fisiológica das ....

Protocolo

1. Desenho de RapR-fosfatases

1. Planeamento
   NOTA: Usando RapR-Shp2 como exemplo, este protocolo detalha as etapas importantes para a criação de uma tirosina fosfatase regulada por rapamicina. O protocolo descrito é otimizado para Shp2 e modificações adicionais podem ser necessárias para se adequar a propriedades específicas de fosfatases individuais.
   1. Para garantir que a atividade catalítica de Shp2 seja puramente controlada pela rapamicina e não por mecanismos endógenos, introduza uma mutação na fosfatase para mantê-la em uma conformação constitutivamente ativa. No caso de Shp2, introduza a mutação D....

Discussão

Este protocolo fornece etapas detalhadas para o desenvolvimento, caracterização e aplicação de fosfatases quimiogeneticamente controladas. A ferramenta RapR-Shp2 depende de um interruptor regulado por rapamicina inserido no domínio catalítico Shp2. A força desta ferramenta é a especificidade e o controle temporal rígido da atividade da fosfatase. A ferramenta é aplicável a outras fosfatases e, em combinação com a tecnologia RapR-TAP descrita anteriormente, permite a reconstr.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20% SDS, 0.5 g bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Published in 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	transfection reagent
Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel Extraction Kit
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Processing Software	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Lysis Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
MATLAB	MathWorks	N/A	R 2022b update was used to run CellGeo functions
Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x objective	Olympus	N/A
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
Primers	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	for electrophoresis
Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100
Antibodies
Anti-EGFR Antibody	Cell Signaling	2232
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-Flag Antibody	Millipore-Sigma	F3165
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP Antibody	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-paxillin Antibody	Thermo Fischer	BDB612405
Anti-phospho-EGFR Y992 Antibody	Cell Signaling	2235
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-paxillin Y31 Antibody	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLCγ Y783 Antibody	Cell Signaling	14008
Anti-PLCγ Antibody	Cell Signaling	5690