Cultura glial entérica equina e aplicação ao estudo de um mecanismo inflamatório neural em cólica equina

Resumo

A glia entérica está se tornando cada vez mais reconhecida por seus papéis na homeostase intestinal e nos processos de doenças, incluindo complicações pós-operatórias. Pacientes equinos em recuperação de laparotomia exploratória de emergência sofrem de alto risco de condições inflamatórias pós-operatórias, destacando a importância de estabelecer cultura de células gliais primárias gliais entéricas equinas repetíveis para estudo.

Resumo

As condições inflamatórias pós-operatórias da cólica equina (abdome agudo) contribuem não apenas para o aumento do custo do cliente, desconforto do paciente e tempo de hospitalização, mas, em muitos casos, provam ser fatais. Uma população única de células intestinais, a glia entérica, é cada vez mais reconhecida por seus papéis na detecção do ambiente gastrointestinal e na comunicação com os tipos de células circundantes. As interações entre a glia entérica e o epitélio intestinal podem ser críticas para estabelecer como a glia entérica equina pode alterar a barreira mucosa para modular a inflamação na saúde e nas cólicas.

Para estudar essa interação, apresentamos um método de estabelecer culturas gliais entéricas equinas primárias do jejuno equino e expor as culturas a condições inflamatórias conhecidas por estarem presentes na cólica. As culturas gliais entéricas primárias foram obtidas de cavalos adultos sacrificados por motivos não relacionados à cólica. As vilosidades intestinais e a lâmina própria foram microdissecadas para expor a submucosa. A submucosa isolada foi submetida à digestão enzimática com colagenase, protease e albumina de soro bovino por 2-3 h. Em seguida, a digestão mecânica envolvendo centrifugação, pipetagem e filtros de células (40-100 μm) produziu um pellet usado para plaqueamento em poços revestidos de poli-L-lisina de 0,05 mg / mL a uma concentração de ~ 400.000 células / 300 μL de meio.

Após a confluência e a primeira passagem, as células gliais entéricas foram então expostas a IL-1β recombinante equina (0, 10, 25 ng) por 24 h. Para modelar as interações epitelial-gliais no momento da cólica, a glia entérica condicionada pelo controle ou tratada foi adicionada diretamente às monocamadas jejunais equinas confluentes enquanto se mede a resistência elétrica transepitelial (TEER) usando uma câmara EndOhm de eletrodo duplo. Esses dados demonstram apenas uma das muitas aplicações potencialmente impactantes da cultura glial entérica equina.

Introdução

A cólica equina é a queixa de apresentação médica mais prevalente para consulta de emergência¹. Com até 17% desses cavalos necessitando de correção cirúrgica, os esforços para aumentar os resultados pós-operatórios devem estar na vanguarda da pesquisa médica equina². Atualmente, os pacientes com cólica pós-operatória apresentam um alto risco de vários distúrbios com risco de vida, incluindo sepse/choque endotoxêmico (12,3% dos pacientes) e íleo paralítico pós-operatório (13,7% dos pacientes)³. Apesar do progresso no tratamento das complicações pós-operatórias, con....

Protocolo

Culturas primárias gliais entéricas equinas foram obtidas de três cavalos sacrificados humanamente com uma overdose de barbitúrico por razões não relacionadas a este estudo. Os cavalos selecionados para os estudos de cultura eram cavalos adultos sem história atual de doença gastrointestinal.

1. Cultura primária glial entérica equina submucosa

1. Cultive monocamadas epiteliais equinas a partir de criptas jejunais obtidas de três cavalos equinos adultos separados.
   1. Cubra as placas de 24 poços com solução de revestimento por 2 h a 37 °C ou durante a noite em temperatura ambiente, ....

Discussão

O objetivo deste estudo foi desenvolver um método repetível de cultura primária de glia entérica submucosa equina e demonstrar sua aplicação para modelar interações epitelial-gliais no momento da cólica. O isolamento e a cultura da glia entérica, que são novos no cavalo, provaram ser benéficos na compreensão das vias da doença intestinal em modelos de porcos e roedores e em humanos 6,7,13,14.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution