Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

Resumo

Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.

Resumo

A optogenética oferece o potencial de imitar o controle espaço-temporal complexo da atividade enzimática até uma resolução subcelular. No entanto, a maioria das abordagens optogenéticas geralmente enfrenta desafios significativos na integração de vários recursos em uma única ferramenta aplicável a uma ampla gama de proteínas-alvo. Alcançar um controle preciso sobre a cinética ON/OFF, garantir o mínimo de vazamento no escuro e demonstrar desempenho eficiente em células de mamíferos com precisão subcelular são alguns dos desafios mais comuns enfrentados neste campo. Uma solução promissora está na aplicação de domínios sensíveis à luz racionalmente projetados para controlar alostericamente a atividade da proteína. Usando essa estratégia, geramos um método optogenético combinando todas as características desejadas. A abordagem envolve a incorporação do módulo de comutação alostérica regulado por luz (LightR) na proteína-alvo para regular a atividade enzimática usando luz azul (465 nm). O domínio LightR é gerado pela ligação de dois domínios fotorreceptores Vivid (VVD), criando um grampo sensível à luz que pode ser incorporado a um pequeno loop flexível dentro do domínio catalítico de uma enzima. Em seu estado escuro, o grampo LightR está aberto, distorcendo assim o domínio catalítico da enzima e inativando-o. Após a exposição à luz azul, o domínio LightR fecha e restaura a estrutura e a atividade enzimática do domínio catalítico. Neste manuscrito, discutimos estratégias de design para gerar uma proteína quinase regulada por luz e demonstrar seu controle por luz azul, reversibilidade, cinética e regulação precisa no nível subcelular, permitindo uma precisão espaço-temporal apertada. Utilizando a tirosina quinase Src como modelo, apresentamos um protocolo para regular efetivamente a atividade da quinase LightR-Src. Também demonstramos a aplicabilidade do LightR em diferentes classes de enzimas, expandindo a utilidade do sistema de ferramentas na abordagem de questões mecanicistas de vias de sinalização em diferentes doenças.

Introdução

A capacidade da célula de interpretar sinais externos e convertê-los em respostas específicas em contextos fisiológicos ou patológicos é dirigida por grupos dedicados de proteínas. A contribuição de qualquer proteína para essas respostas complexas é frequentemente definida por sua localização subcelular, nível de expressão e tempo de ativação transitória, sustentada ou oscilatória. Dissecar o papel desses parâmetros individuais na regulação da sinalização exige métodos capazes de replicar o intrincado controle espaço-temporal da atividade proteica no nível subcelular. Técnicas tradicionais, como manipulação genética e inibidores de pe....

Protocolo

1. Projeto e desenvolvimento do LightR (Figura 1)

1. Planejamento estratégico
   NOTA: O domínio LightR é composto por dois domínios fotorreceptores Vivid (VVD) conectados em tandem de Neurospora crassa^13,14,15,16. Os VVDs homodimerizam na presença de luz, e tal dimerização envolve uma mudança conformacional que traz o terminal N de um monômero VVD próximo ao terminal C de outro monômero VVD (Figura 1A). A ....

Discussão

Nosso estudo apresenta uma abordagem optogenética para a investigação de diversas vias de sinalização e demonstra sua ampla aplicabilidade na abordagem de diferentes questões biológicas. O sistema de ferramentas LightR oferece várias vantagens essenciais: (1) Regulação alostérica da atividade da proteína, (2) Controle temporal rígido da atividade que pode ser ajustado para alcançar diferentes cinéticas de ativação e inativação, (3) Resolução espacial da atividade no .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100