A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos

Resumo

Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada que oferece informações abrangentes sobre o glicoproteoma heterogêneo em microambientes tumorais complexos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

Resumo

A glicosilação é uma modificação proteica comum e estruturalmente diversa que afeta uma ampla gama de processos tumorigênicos. A glicômica e a glicoproteômica orientadas por espectrometria de massa surgiram como abordagens poderosas para analisar glicanos liberados e glicopeptídeos intactos, respectivamente, oferecendo uma compreensão mais profunda do glicoproteoma heterogêneo no microambiente tumoral (TME). Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada, que primeiro emprega glicômica baseada em carbono poroso grafitizado LC-MS / MS para elucidar as estruturas glicânicas e sua distribuição quantitativa no glicoma de tecidos tumorais, populações de células ou fluidos corporais que estão sendo investigados. Isso permite uma análise glicômica comparativa para identificar glicosilação alterada em grupos de pacientes, estágios de doenças ou condições e, mais importante, serve para aprimorar a análise glicoproteômica a jusante da(s) mesma(s) amostra(s), criando uma biblioteca de estruturas de glicanos conhecidas, reduzindo assim o tempo de pesquisa de dados e a taxa de identificação incorreta de glicoproteínas. Com foco no perfil de N-glicoproteoma, as etapas de preparação da amostra para o método glicoproteômico guiado por glicômica são detalhadas neste protocolo e os principais aspectos da coleta e análise de dados são discutidos. O método glicoproteômico guiado por glicômica fornece informações quantitativas sobre as glicoproteínas presentes no TME e seus locais de glicosilação, ocupação do local e estruturas de glicanos específicos do local. Resultados representativos são apresentados a partir de tecidos tumorais fixados em formalina e embebidos em parafina de pacientes com câncer colorretal, demonstrando que o método é sensível e compatível com seções de tecido comumente encontradas em biobancos. A glicoproteômica guiada por glicômicos, portanto, oferece uma visão abrangente da heterogeneidade e dinâmica do glicoproteoma em TMEs complexos, gerando dados bioquímicos robustos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

Introdução

A glicosilação de proteínas é um tipo prevalente e complexo de modificação co- e pós-traducional de proteínas produzidas por espécies em toda a árvore filogenética da vida ^1,2,3. Os glicanos ligados a proteínas são conhecidos por impactar uma ampla gama de processos biológicos importantes para a saúde humana, incluindo mediação e regulação de interações celulares e eventos de comunicação ^4,5. Acredita-se que a glicosilação de proteínas aberrantes seja uma causa de transformação malign....

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana (Ciências Médicas) da Universidade Macquarie, Sydney, Austrália (Protocolo 5201800073).

NOTA: O método glicoproteômico guiado por glicômica pode ser aplicado a um conjunto diversificado de amostras biológicas que variam de baixa a extrema complexidade de glicoproteína. Para abordagens glicoproteômicas sem marcação (nas quais o agrupamento de amostras não é realizado), aproximadamente 100-200 μg de proteína total de misturas complexas são necessários como material de partida para garantir alta cobertura de glicoproteoma após o enriquecimento para ....

Resultados

Os resultados representativos do método glicoproteômico guiado por glicômica aplicado a uma lâmina de tecido FFPE de um paciente que sofre de CCR no estágio II são fornecidos nesta seção.

Para obter material de partida proteico suficiente para o protocolo, extratos de proteínas de duas lâminas (pilhas z) foram combinados do mesmo bloco de tecido FFPE seguindo um protocolo publicado e uma abordagem de marcação TMT foi aplicada para aumentar a sensib.......

Discussão

Etapas críticas no protocolo
Neste artigo de protocolo, descrevemos passo a passo o método glicoproteômico guiado por glicômica, que fornece uma visão abrangente da heterogeneidade e dinâmica do glicoproteoma no TME complexo.

Uma etapa crítica no protocolo é garantir a proteólise completa sem digerir demais a mistura de proteínas. Clivagens inespecíficas de proteínas aumentam inerentemente o espaço de busca de peptídeos, levan.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Ammonium acetate	Sigma Aldrich	A1542	Alternatives available
Ammonium bicarbonate, purity ≥99.0%	Sigma Aldrich	A6141	Alternatives available
Anhydrous acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Sigma Aldrich	34851	Alternatives available
Bovine fetuin	Sigma Aldrich	F3004	Alternatives available
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	D0632	Alternatives available
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Alternatives available
Formic acid, LC-MS grade	Sigma Aldrich	00940	Alternatives available
Glacial acetic acid	Sigma Aldrich	A6283	Alternatives available
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I1149	Alternatives available
Methanol	Sigma Aldrich	M1775	Alternatives available
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)	Promega	V4831	Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinantly expressed in Escherichia coli
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)	Sigma Aldrich	PVP40	Alternatives available
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	484016	Alternatives available
Sequencing-grade porcine trypsin	Promega	V5113	Alternatives available
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma Aldrich	213462	Alternatives available
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), LC-MS grade	Sigma Aldrich	T7408	Alternatives available
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Sigma Aldrich	T6508	Alternatives available
Tools/Materials
C18 disks	Empore	66883-U
C8 disks	Empore	66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate	Corning	3364
Immobilon-PSQ polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH20200	Pore size: 0.45 μm
Microcentrifuge	Eppendorf	5452000069	Alternatives available
Microcentrifuge adapters	The Nest Group, Inc., MA	SS18V	MiniSpin Column Collar, comes with Microspin Columns
Oligo R3 resin	Thermo	1133903	Particle size 30 μm
Parafilm	Parafilm M	PM996
Protein LoBind tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030108450
Protein LoBind tubes 2.0 mL	Eppendorf	0030108442
Safe-lock tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
Safe-lock tubes 2.0 mL	Eppendorf	0030120094
Shaker	Eppendorf	5382000066	Alternatives available
Single hole puncher	Swingline	74005
SpeedVac concentrator	Martin Christ	RVC 2-25 CDplus	Alternatives available
Supelclean ENVI-Carb SPE resin	Supelco	57088	Particle size 120-400 mesh. Resin can be manually extracted from cartridges, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
Syringe 5 mL	Sigma Aldrich	Z116866	Alternatives available
Temperature-controlled incubator	Thermoline	E7.30	Alternatives available
Ultrasonic bath	Unisonics	FXP	Alternatives available
ZIC-HILIC resin	Merck	150455	Particle/pore size, 5 μm/200 Å. Resin can be manually extracted from LC column, and can be stored long-term in 50% (v/v) methanol in MilliQ water
ZipTip C18 solid-phase extraction (SPE) micro-columns	Millipore	ZTC18S096	Alternatively, home-made C18-SPE micro-columns can replace commercial product
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC system	Agilent		Alternatives available
Analytical LC column pre-packed with ReproSil-Pur C18 AQ resin	Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany	r13.aq.s2570	Particle/pore size: 3 μm/120 Å, length/inner diameter: 25 cm/75 μm. Commercial C18 nano-LC columns also available/
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC System	Thermo		Alternatives available
HyperCarb KAPPA PGC capillary LC column	Thermo	Discontinued	Particle/pore size, 3 μm/250 Å; column length, 30 mm; inner diameter, 0.180 mm. Larger geometries of the HyperCarb PGC-LC columns, producing similar quality data are commercially available (e.g., Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC column from Merck with a particle/pore size, 2.7 μm/200 and with different column lengths and internal diameter are also available (e.g., Merck #59994-U).
LCMS-grade acetonitrile	LiChrosolv	100029	Alternatives available
Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap mass spectrometer (glycomics)	Thermo		Alternatives available
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)	Thermo		Other high-resolution MS systems with or without ETD (only required for O-glycoproteomics) are also available (e.g., Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker or similar high performance mass spectrometers from other vendors)
Total Recovery Clear Glass screw vials 0.9 mL	Thermo	THC11093563	Alternatives available
Total Recovery Clear Glass screw vials matching caps	Thermo	THC09150869	Alternatives available
Trap LC column packed in-house with ReproSil-Pur C18 AQ resin	Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany	r15.aq.s0202	Particle/pore size: 5 μm/120 Å, length/inner diameter: 2 cm/100 μm. Commercial C18 trap LC columns also available.
Software
Byonic	Protein Metrics Inc	v2.6.46 or higher	Commercial glycopeptide and PTM search engine, accepting LC-MS/MS raw data from most MS vendors
Byos	Protein Metrics Inc	v3.9-7 or higher	Commercial software for manual inspection of glycopeptide candidates and the automatic annotation of glycan MS/MS spectra
GlycoMod	Expasy		Open access software, assisting the annotation of glycomics data (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBench	EUROCarbDB	v2.1	Open access software, assisting the annotation of glycomics data and the drawing of glycan cartoons
RawMeat	VAST Scientific	v2.1	Open access software, extracting m/z of glycan precursor ions from raw spectral data
Skyline	Brendan X. MacLean	v21.2 or higher	Open access software for relative quantitation of glycans
Xcalibur	Thermo	v2.2 or higher	For browsing raw LC-MS/MS data