Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Resumo

O protocolo aqui apresentado envolve o perfil polissômico para isolar translatome, mRNAs associados a ribossomos, em RNAs não polissomais e polissomais de Arabidopsis por meio de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. Este método demonstra a eficiência de tradução de Arabidopsis estressada pelo calor.

Resumo

O controle translacional de diferentes genes sob estresse térmico é uma etapa crítica para a adaptação das plantas ao ambiente. Avaliar as atividades translacionais de vários genes pode nos ajudar a entender os mecanismos moleculares subjacentes à resiliência das plantas, contribuindo para o desenvolvimento de culturas com maior tolerância ao estresse diante das mudanças climáticas globais. Este trabalho apresenta uma metodologia detalhada para avaliar a eficiência da tradução por meio de perfis polissômicos em plantas expostas ao estresse térmico. O procedimento é dividido em três partes: tratamento de estresse térmico para Arabidopsis, teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos e cálculo da eficiência de tradução isolando RNA não polissômico e polissômico com base no perfil. Na primeira parte, as plantas de Arabidopsis são submetidas a condições controladas de estresse térmico para mimetizar os desafios ambientais. O tratamento envolve a exposição das plantas a altas temperaturas por períodos especificados, garantindo uma indução de tensão consistente e reprodutível. Esta etapa é crucial para estudar as respostas fisiológicas e moleculares da planta ao estresse térmico. A segunda parte envolve o teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos. Os polissomas são extraídos por centrifugação por gradiente de sacarose, que separa os mRNAs com base na carga ribossômica. Isso permite o exame da ocupação do ribossomo em mRNAs, fornecendo informações sobre os mecanismos de controle translacional sob condições de estresse. Na terceira parte, o RNA é isolado de frações polissomais e não polissomais. O RNA spike-in é usado para medir com precisão a quantidade de RNA em cada fração. O cálculo da eficiência da tradução é realizado comparando a distribuição de mRNAs entre essas frações em condições normais e de estresse térmico. As atividades de tradução de genes específicos são avaliadas posteriormente pela realização de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) com RNA associado ao ribossomo e RNA total. Esta metodologia foca-se exclusivamente nos efeitos do stress térmico, fornecendo um protocolo detalhado para análise da regulação translacional em plantas.

Introdução

A tradução é crucial para os organismos sintetizarem proteínas funcionais a partir do mRNA, apoiando funções celulares essenciais e processos biológicos como metabolismo e sinalização e permitindo respostas ao estresse. Sem tradução, as células não podem produzir proteínas vitais, impactando sua estrutura, função e regulação, afetando assim a sustentação da vida e promovendo a diversidade biológica ^1,2. Portanto, estudar a eficiência translacional das plantas é crucial. A tradução envolve várias etapas essenciais. Primeiro, a iniciação ocorre quando o mRNA se liga a um ribosso....

Protocolo

1. Preparação de amostra de mudas de Arabidopsis tratada com estresse térmico

1. Plaquear 250 sementes para cada repetição e cada condição com um conta-gotas no papel de filtro colocado na placa de ágar meio basal Murashige e Skoog (MS) sem sacarose (pH 5,6) suplementada com 1,2% de fitoágar.
   NOTA: Para plantar mudas em placas MS, papel de filtro estéril é colocado na placa para evitar que as raízes das mudas penetrem profundamente no meio, facilitando a amostragem. As sementes são então plantadas em cima do papel de filtro. Para excluir a influência dos açúcares n....

Discussão

Este protocolo descreve um método simples e padronizado para medir a eficiência de tradução de mudas de Arabidopsis. As etapas críticas deste protocolo são garantir a estabilidade do RNA com centrifugação secundária e extração de reagente de extração de RNA, bem como a preparação meticulosa do gradiente de sacarose. Além disso, fornecemos etapas críticas para normalizar e quantificar o RNA não polissômico e polissômico com o método de normalização spike-in. É muit.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile