Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

Resumo

Aqui, demonstramos como as células epiteliais cultivadas com fibroblastos no sistema de duas camadas baseado em membrana nanofibrosa podem aderir e crescer de forma estável na membrana.

Resumo

Os obstáculos técnicos em uma cultura de células epiteliais incluem desdiferenciação e perda de função. Os métodos biomiméticos de cultura de células tridimensionais (3D) podem aumentar a eficiência da cultura de células. Este estudo apresenta um sistema avançado de cultura de duas camadas destinado a cultivar células epiteliais como camadas semelhantes a tecidos com a cultura de fibroblastos em um ambiente 3D. As membranas nanofibrosas (NMs) de álcool polivinílico (PVA) e poli(ε-caprolactona) (PCL) foram fabricadas por eletrofiação e utilizadas como matriz extracelular fisiologicamente relevante para o cultivo de células epiteliais e fibroblastos, respectivamente. Nos poços de inserção superiores, as células epiteliais pulmonares foram cultivadas no NM do PVA e, nas câmaras inferiores, os fibroblastos foram cultivados no NM do LCP. Essa configuração elimina o contato direto célula-célula e facilita o exame da sinalização parácrina mediada por fatores solúveis. A microscopia confocal foi empregada para analisar a distribuição, o padrão de crescimento e a expressão de proteínas intracelulares, incluindo zona occludens em células epiteliais. As técnicas de empilhamento Z permitiram reconstruções 3D detalhadas, fornecendo informações precisas sobre a integridade das junções apertadas e a organização espacial dentro da camada epitelial. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) avaliou as características morfológicas dos tipos celulares nas membranas nanofibrosas. A imagem de MEV revelou estruturas intrincadas da superfície celular e interações com as nanofibras, oferecendo uma perspectiva abrangente sobre a arquitetura celular e a interação celular com a estrutura nanofibrosa. O ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) é um método simples para medir as taxas de crescimento de células epiteliais e fibroblastos ao longo do tempo. Ele fornece os comportamentos proliferativos e os potenciais efeitos sinérgicos da cocultura dessas células. Esses achados destacam a eficácia de um sistema de co-cultura de inserção simples para cultura simultânea de fibroblastos e células epiteliais, o que é crucial em vários contextos fisiológicos e farmacológicos, incluindo regeneração de tecido epitelial, microambiente tumoral com células endoteliais, imunes e outras células do estroma, ensaio de toxicidade e teste de atividade de drogas.

Introdução

Ao longo das décadas, a clássica cultura de monocamada bidimensional (2D) tem sido essencial para a compreensão de infecções, farmacologia e toxicologia ^1,2. No entanto, é importante considerar a complexidade, as interações dinâmicas entre as multicomposições e a arquitetura tridimensional (3D) do microambiente tecidual. Assim, a cultura de células 2D tem limitações em mimetizar estruturas semelhantes a tecidos ^3,4. Por exemplo, há uma falta de sinalização célula a célula e célula a matriz extracelular (ECM), que é ess....

Protocolo

1. Fabricação de nanofibras de PVA estáveis à água

1. Pese 0,02 g de poli (ácido acrílico) (PAA) e 1 g de PVA e, em seguida, adicione-os em um frasco de vidro limpo contendo uma barra magnética. Adicione 7,8 mL de água destilada à garrafa, coloque a garrafa em um agitador de pratos e ajuste a temperatura para 84 °C, a velocidade para 500 rpm e o tempo para 12 h.
2. Deixe o frasco esfriar até a temperatura ambiente antes de adicionar 0,2 mL de glutaraldeído (GA). Coloque a garrafa no agitador de placas e ajuste a velocidade para 500 rpm, o tempo para 30 min e a temperatura para a temperatura ambiente.

Resultados

Este protocolo descreve as etapas críticas para a cocultura de células epiteliais pulmonares MLE-12 e fibroblastos NIH3T3, construindo um modelo de duas camadas baseado em membrana nanofibrosa (Figura 1). Este modelo é adequado para imagens de células vivas, imuno-histoquímica e análise quantitativa de endpoint de células cocultivadas. Outros tipos de células também podem ser utilizados otimizando a densidade celular e as condições de crescimento........

Discussão

A transição da cultura 2D para os modelos de cultura 3D representa um avanço significativo no desenvolvimento de modelos de cocultura in vitro . Um modelo de cultura 3D deve imitar o microambiente do tecido no qual as células podem proliferar, agregar e se diferenciar²². O uso de modelos de cocultura 3D baseados em andaimes aumenta a replicação da arquitetura do tecido. Neste estudo, um sistema trans-well baseado em NM fornece cocultura 3D indireta .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin/EDTA	Welgene	LS015-01
100x Penicilin/Streptomycin	Gibco	10378016
20x PBS	LPS solution	CBP007A
4% Paraformaldehyde	Biosesang	PC2031-050-00
Alexa Fluor-594 conjugated ZO-1 antibody	Invitrogen	339194
Antibody diluent OP Quanto	Epredia	10129-576
CCK-8 assay kit	Donginbio	CCK-3000
Cell culture dish (150x20)	SPL	20151
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen	C34552
Chloroform	Samchun	C0584
Conical tube	SPL	50050
Cover glass	Corning	CLS2980245
DMEM high glucose	Welgene	LM001-05
DMEM/F12	Welgene	LM 002-05
DURAN Desiccator bases with plane flange, screw thread	DWK Life Sciences	7.022 260
DURAN Glass Desiccator Lid & Stopcock	Daihan Science	SM.2444061
DURAN Stopcock, with PTFE Spindle	DWK Life Sciences	10322671
Electrospinning machine	NanoNC	ESR200RD
Ethyl alcohol, Pure	Sigma Aldrich	459844
FBS	Sigma Aldrich	TMS-013-BKR
Fluorescence Laser Confocal Scanner Module K1-fluo	Nanoscope Systems
Gel/mount	Biomeda Corp.	M01
Glutaraldehyde solution	Sigma Aldrich	340855
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Metal nozzle 27G	NanoNC
Nail polish	Nature republic
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000
Osmium tetroxide	Sigma Aldrich	201030
Phalloidin-iFlour 488	abcam	ab176753
Plastic Syringe_Lure Lock (10 mL)	HENKE SASS WOLF	AL10
Poly(acrylic acid)	Sigma Aldrich	323667
Poly(vinyl alcohol)	Sigma Aldrich	341584
Polycaprolactone	Sigma Aldrich	440744
Pure HCL	Duksan	1129
Scanning Electron Microscopy	SEC	SNE-4500M
Slide glass	Marienfeld Superior	K15663717
Sylgard 184 set	omniscience	OMNI.05255
Synergy H1 Multimode Reader	Biotek
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100