Prepare uma máquina de congelamento a alta pressão ou HPF, pelo menos duas horas antes de iniciar o experimento, de acordo com as instruções do fabricante. Transfira os transportadores de alumínio HPF Tipo A para um tubo centrífugo de dois milímetros contendo um mililitro de etanol e sonice-os em um limpador ultrassônico por 10 minutos. Seque os suportes em uma placa de Petri coberta com papel filtro qualitativo.
Mergulhe os suportes pré-limpos em 1-hexadeceno. Use pinças finas para pegar um disco de safira pré-preparado do prato de cultura de células HeLa. Toque a superfície rotulada com papel de filtro qualitativo para remover o excesso de meio.
Monte o disco de safira no suporte da amostra HPF e cubra rapidamente o disco com um suporte de alumínio de 0,025 milímetros de profundidade contendo 1-hexadecena. Aspirar o excesso de solução com papel de filtro qualitativo. Carregue o porta-amostras para congelamento a alta pressão.
Descarregue o conjunto transportador do disco de safira sob nitrogênio líquido em uma caixa de crio de espuma. Prepare dois mililitros da fixação de substituição por congelamento ou solução FSF um em um recipiente redondo de polipropileno de 20 milímetros em um exaustor e congele-o usando nitrogênio líquido. Use um par de pinças pré-resfriadas para carregar os discos de safira e os conjuntos transportadores no recipiente com solução FSF congelada sob nitrogênio líquido.
Transfira este recipiente para uma câmara de máquina de substituição de congelamento automatizada pré-resfriada para processamento FSF a menos 90 graus Celsius. Mantenha os espécimes a menos 90 graus Celsius por uma hora e, em seguida, separe os discos de safira dos suportes com pinças pré-resfriadas, certificando-se de que os lados marcados dos discos de safira estejam voltados para baixo. Mantenha os espécimes a menos 90 graus Celsius por mais 8 a 10 horas antes de aquecer até 60 graus Celsius negativos dentro de três horas.
Substitua a solução FSF no recipiente por acetona pré-resfriada e incube a menos 60 graus Celsius por uma hora. Repita esta lavagem de acetona duas vezes. Aqueça até 30 graus Celsius negativos em três horas.
Enquanto isso, prepare e pré-resfrie dois mililitros de solução FSF dois em um tubo centrífugo de dois mililitros a menos 30 graus Celsius. Substitua a acetona por uma solução FSF dois e incube a menos 30 graus Celsius por três horas. Em seguida, substitua a solução FSF dois no recipiente com acetona pré-resfriada e incube por 30 minutos a menos 30 graus Celsius.
Repita esta lavagem de acetona duas vezes. Aqueça por menos 30 a 4 graus Celsius dentro de duas horas. Substitua a acetona por dois mililitros de tampão HEPES 0,2 molar.
Troque o tampão uma vez e incube à temperatura ambiente ou quatro graus Celsius durante a noite.
