Comece esterilizando as lâminas de politetrafluoretileno ou PTFE, imergindo-as em etanol 70% por 10 minutos em um gabinete de biossegurança. Deixe as lâminas secarem ao ar em uma placa estéril de cultura de células de 100 milímetros. Coloque cada lâmina em 1 nova placa de cultura de células de 100 milímetros e adicione 200 microlitros de meio de cultura celular contendo soro em cada retângulo.
Em seguida, coloque uma luz UV portátil de 254 nanômetros na placa de cultura de células de 100 milímetros com a lâmpada diretamente voltada para a lâmina por 20 minutos. Descongele as alíquotas congeladas dos segmentos externos, ou OS, em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, gire o sistema operacional em 2, 400G por cinco minutos à temperatura ambiente.
Aspirar imediatamente o sobrenadante no gabinete de biossegurança usando uma pipeta e ressuspender o OS em PBS. Agora, aspirar o meio das lâminas e colocar até 500 microlitros da solução PBS de 2 x 10 a 8 OS por mililitro da solução PBS de 2 x 10 a 8 OS por mililitro em cada retângulo de lâmina. Coloque uma luz UV portátil de 254 nanômetros sobre a placa de cultura de células com a lâmpada diretamente voltada para o sistema operacional por 40 minutos.
Colete a solução OS-PBS em um tubo de 1,5 mililitro. Lave o retângulo da lâmina revestida com 200 a 500 microlitros de PBS e colete cada lavagem no tubo da microcentrífuga. Em seguida, gire a solução OS-PBS a 2.400G por cinco minutos à temperatura ambiente.
Aspirar o PBS no gabinete de biossegurança com um pipetter e ressuspender o pellet em 500 microlitros de meio padrão a ser usado para o epitélio pigmentado da retina, ou culturas de EPR. Coloque 10 microlitros da suspensão em um tubo de microcentrífuga novo. Diluir de 50 a 100 vezes com mais meio de cultura celular e contar o EO com um hemocitômetro.
Diluir o SO foto-oxidado, ou suspensão OxOS, em uma concentração de 5,6 x 10 a 7º OS por mililitro em um meio RPE padrão. Adicionar ligantes em ponte de fagocitose, que facilitam a captação de EO e o acúmulo de lipofuscina. Em seguida, aliquote o OxOS em estoques de uso único e congele rapidamente em nitrogênio líquido.
Descongelar alíquotas de OxOS diluindo a alíquota congelada em 45 microlitros de meio de cultura celular antes de adicioná-la aos transwells de EPR para induzir o acúmulo de lipofuscina. Em seguida, caracterize o EO oxidado medindo o espectro de emissão do OxOS usando varredura Lambda em um microscópio confocal. A imagem confocal mostrou que o EO tratado teve aumento da autofluorescência em comparação com o EO não tratado.
