Para começar, tome o transwell fixo com culturas de EPR carregadas de lipofuscina. Após lavar as culturas com PBS cinco vezes, deixar uma pequena quantidade de PBS na câmara apical. Coloque o transwell de cabeça para baixo sob um microscópio dissecante.
Usando uma lâmina de barbear, corte a membrana semiporosa do transwell aplicando a força de corte na junção da membrana e do transwell. Uma vez cortada a membrana de transwell, coloque-a em uma lâmina de microscópio usando pinças. Limpe o excesso de PBS com um apagamento de tarefas, evitando tocar nas células.
Adicione o meio de montagem seguido de uma tampa. Certifique-se de manter o controle de qual lado da transwell está do lado direito para cima. Em seguida, detectar o antígeno de interesse usando um fluoróforo, com pico de excitação em torno de 488 nanômetros e detecção de emissão em 500 a 530 nanômetros.
Configure um canal separado para detecção de autofluorescência, com excitação de 405 nanômetros e emissão de 585 a 635 nanômetros. Grânulos autofluorescentes induzidos por OxOS apresentaram maior acúmulo após 20 mamadas em comparação com cinco mamadas. A imagem ratiométrica ajudou a decifrar a autofluorescência UAM da LC3 marcada com Alexa 488.
O canal vermelho contém apenas material de autofluorescência indigesto e ajudou a separar o sinal LC3 do canal verde.
