Para começar, calcule o número de poços necessários para o experimento. Em seguida, descongele uma quantidade apropriada de amostra de SO regular. Adicione mídia RPE suficiente para atingir uma concentração final de SO de quatro vezes 10 a sexta por mililitro.
Retirar o meio apical e adicionar 50 microlitros de quatro vezes 10 ao sexto OS por mililitro com concentrações adequadas de ligantes em ponte. Após a adição do SO, incube as amostras por vários pontos de tempo. No final da incubação, adicionar 16,67 microlitros de quatro vezes tampão de amostra Laemmli com inibidores de protease para lisar as células e o OS sobrejacente contendo sobrenadante.
Usando uma pipeta P200, risque a superfície Transwell e colete o sobrenadante celular combinado e o lisado celular juntos. Vórtice e deixe à temperatura ambiente durante 30 minutos para uma desnaturação completa. O Western blot da rodopsina mostrou que a banda de rodopsina intacta era indistinguível nas células controle e carregadas de EPR carregadas de UAM.
No entanto, os produtos de clivagem da rodopsina foram maiores no grupo MAS, sugerindo alguma disfunção degradativa leve no sistema fagolisossomal. Os níveis iguais de GAPDH indicam que a contagem de células entre os poços é igual. Diferentes anticorpos contra rodopsina reconhecem diferentes fragmentos de degradação.
4D2 reconhece o término final da rodopsina que está intacto até os últimos passos da degradação lisossômica. Em contraste, 1D4 reconhece o término C da rodopsina que é degradado mais cedo no processo fagolisossomal.
