Ligue todos os componentes de configuração de aquisição para a medição de fluorometria. Coloque a placa de fundo de vidro de 35 milímetros contendo as fibras musculares dissociadas no palco do microscópio. Remova cuidadosamente o meio de cultura com uma pipeta de 1.000 microlitros e substitua-o por 2 mililitros de solução de campainha à temperatura ambiente.
Usando um manipulador mecânico ou motorizado, coloque os dois fios de platina perpendicularmente ao fundo da placa. Certifique-se de que os terminais do eletrodo estejam alinhados em relação ao eixo longitudinal da fibra e a alguns milímetros de distância das extremidades da fibra. Ajuste o posicionamento do eletrodo girando a placa ou movendo cada eletrodo se montado em um micromanipulador independente.
Acenda a luz transmitida e encontre as fibras no campo de visão usando uma objetiva de 20 X. Mova o cubo de filtro EGFP para o caminho de luz. Depois de desligar a luz transmitida, ative a luz de excitação de 488 nanômetros usando um obturador de luz controlado remotamente.
Para identificar as fibras positivas do EGFP, centralize as fibras com o sinal EGFP mais brilhante no meio do campo de visão. Use um diafragma posicionado no caminho da luz de excitação para focar a luz de excitação em uma área específica da fibra. Isso permite a aquisição de sinais, onde o sinal EGFP CaV1.1 é máximo.
Ajuste a posição da fibra com o estágio mecânico para alinhar com o caminho de luz do diafragma e armazene a localização da fibra XY. Depois de retornar à primeira localização salva, defina a duração de dois pulsos de estimulação sequenciais para 1 milissegundo, a amplitude para 20 volts e a polaridade dos pulsos para alternada. Em seguida, use um interruptor de gatilho manual para entregar os dois pulsos sequenciais.
Durante a estimulação, observar duas contrações concêntricas de fibras homogêneas em resposta aos dois pulsos de polaridade oposta. Se nenhuma contração ou apenas uma contração concêntrica for observada com pulsos de polaridade alternada, descarte as fibras do restante do experimento. Adicione 2 microlitros de solução de 10 milimolares MTS 5 TAMRA diretamente no prato e misture suavemente com uma pipeta de 1.000 microlitros.
Incubar por quatro a cinco minutos para permitir a difusão da molécula fluorescente de tiol no lúmen do sistema tubular transverso. Através da estimulação de campo, aplicar estímulos repetitivos bipolares para evocar trens potenciais de ação sucessivos a uma taxa de 50 hertz por 300 milissegundos a cada 1 segundo por 5 minutos. Retire a solução corante do prato com uma pipeta de 1.000 microlitros.
E substitua-o por 2 mililitros de solução de campainha à temperatura ambiente. Deixe a fibra corada se recuperar do protocolo de coloração por pelo menos 10 minutos. Depois de reavaliar a saúde da fibra e a atividade elétrica com dois pulsos alternados, mova o cubo do filtro MTS 5 TAMRA para o caminho da luz e ative a luz de excitação de 533 nanômetros com um obturador de luz controlado remotamente para confirmar visualmente a coloração nas fibras.
Em seguida, usando o local armazenado no estágio motorizado, coloque a fibra no meio do campo com o cubo de filtro MTS 5 TAMRA, o diafragma e a objetiva de imersão em óleo 60X. Após reorientar os fios de platina de estimulação de campo em cada extremidade da fibra, alinhe os fios no eixo principal das fibras em linha reta e espaça-os cinco milímetros entre si, com a fibra no centro. No software de aquisição, selecione o protocolo que será utilizado para aquisição.
Esta etapa é controlada apenas com o computador, e aciona todos os dispositivos a jusante para estimulação elétrica e controle do obturador do caminho da luz. Para cada protocolo, minimizar ao máximo o tempo total de aquisição para evitar clareamento de sinal, mas permitir algumas dezenas de milissegundos de iluminação luminosa e aquisição de sinal antes da primeira estimulação elétrica para registrar uma linha de base. Execute o protocolo pressionando Executar.
O sinal gravado é exibido automaticamente na tela. A pequena amplitude do sinal e a rápida contração mecânica da fibra muitas vezes escondem a maior parte do sinal e exibem um artefato de movimento. Adicione 1 micromolar de 100 milimolares e benzoyl para tolueno sulfonamida à solução de gravação para minimizar as respostas contratuais e distinguir ainda mais o sinal decorrente dos movimentos de S4 devido à ativação da fibra.
Depois de alguns minutos, execute o mesmo protocolo uma segunda vez. O artefato de movimento agora é removido, mas uma pequena mudança de fluorescência correspondente ao movimento de S4 permanece. Mova levemente o prato usando o estágio mecânico para adquirir um sinal de uma área sem fibras ou detritos.
Execute o protocolo uma última vez para gravar a fluorescência de fundo. Exporte os rastreamentos e use um programa de planilha para expressar o sinal como delta f sobre f 0 em função do tempo e aplique a correção da linha de base, se necessário. Os exemplos de imagens transmitidas e fluorescentes do músculo dissecado e não dissociado expressando uma construção EGFP CaV1.1 são mostrados aqui.
As imagens representativas de uma fibra muscular expressando uma construção EGFP CaV1.1 VS D3 antes e após a coloração MTS 5 TAMRA são mostradas nesta figura. Este corante também cora cisteínas endógenas de fibras não transfectadas. As imagens confocais de um constructo EGFP CaV1.1 VS D3 e coloração MTS 5 TAMRA mostram um padrão de banda dupla característico da localização de CaV1.1 no sistema tubular transverso da fibra muscular.
O registro fluorométrico representativo em resposta a dois estímulos e medido com um fotodiodo é mostrado aqui. Ambos os sinais são normalizados por seu valor mínimo e plotados em função do tempo em relação à sua respectiva despolarização. Esses registros mostram que a fase ascendente e o tempo para o pico do sinal são semelhantes para ambas as despolarizações impostas à fibra.
