Para iniciar o preparo da amostra, disseque a folha verdadeira da amostra transgênica de Arabidopsis thaliana tratada farmacologicamente usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque a folha verdadeira em uma lâmina de vidro em uma gota de água com o lado abaxial para cima. Cubra lentamente a folha verdadeira com uma tampa sem bolhas de ar.
Para geração de imagens, configure o caminho do feixe selecionando um laser de 514 nanômetros para proteína fluorescente amarela ou excitação YFP. Obtenha alta qualidade de imagem usando alta potência de laser. Ative o PMT ou o HYD e defina os limites superior e inferior da banda de emissão com base no espectro do fluoróforo YFP.
Defina uma janela de detecção de 530 a 570 nanômetros para coletar o sinal YFP. Para a imagem sequencial da segunda cor, clique no botão Buscar e adicione um novo canal. Na busca dois, selecione um laser de 555 nanômetros para a proteína fluorescente vermelha, ou excitação RFP, e defina uma janela de detecção de 570 a 630 nanômetros para coletar o sinal RFP.
Selecione uma lente central de 63X e 1,2W no sistema para obter imagens da atividade de tráfego da membrana subcelular dentro das células precursoras estomáticas. Inicie o formato com um tamanho de imagem de 1024 por 1024 pixels e, em seguida, otimize-o com base no fator de zoom e nas configurações de objetivo para uma boa resolução. Em seguida, configure a velocidade da cabeça de varredura, começando com uma velocidade de 400 hertz, e otimize-a com base na situação específica das amostras.
Para ampliar uma região de interesse sem alterar a lente objetiva, insira um fator de zoom de um e otimize-o com base nas necessidades específicas do experimento. A média da linha refere-se ao número de vezes que cada linha X será digitalizada para obter um resultado médio. Comece com uma média de linha de 2X para obter imagens dos eventos de tráfego de membrana e otimize conforme necessário.
selecione o modo de varredura XYT no modo de aquisição para habilitar o utilitário de série temporal. Em seguida, selecione o período de espera entre os pontos de tempo em intervalo de tempo. Defina o número de quadros a serem coletados selecionando quadros.
Use o modo de varredura Z-stack com a projeção de intensidade máxima para coletar as informações tridimensionais sobre o evento de tráfego de membrana dentro de toda a célula. Em seguida, selecione o modo de verificação XYZ no modo de aquisição e, em seguida, o utilitário Z-stack ficará acessível. Selecione a opção Z wide.
No modo de varredura, defina as imagens superior e inferior da pilha Z usando os botões de início e fim. Em seguida, defina a espessura do passo Z clicando no tamanho do passo Z. Para processar a imagem, clique na guia do processo primário no software Confocal.
Na guia abrir projetos no lado esquerdo, selecione o arquivo Z-stack interessado. Em seguida, na guia do meio chamada ferramentas de processo, selecione a função de projeção. Escolha o máximo no painel suspenso do método e clique no botão aplicar.
Uma imagem de projeção Z-stack será gerada na guia projetos abertos. Para gerar o vídeo a partir das imagens de séries temporais, clique na guia de arquivo no software Fiji e abra a função para abrir todas as imagens de séries temporais, uma a uma, na ordem correta. Como alternativa, arraste as imagens para a imagem J para abrir os dados na ordem correta.
Em seguida, encontre a função de pilha na guia imagem e escolha as imagens a serem empilhadas para gerar um vídeo. Uma vez feito, salve o arquivo no formato avi com a taxa de quadros desejada. Na folha verdadeira de plantas transgênicas de sete dias de idade portadoras do promotor ERL1 YFP, células dispersas foram destacadas pelo sinal YFP onde ERL1 YFP marcou a membrana plasmática.
Múltiplos sinais puntiformes também foram observados, sugerindo que ERL1 também estava localizado nos endossomos. RFP Ara7 destacou múltiplos sinais puntiformes em quase todas as células, indicando os corpos multivesiculares, ou MVBs, nessas células. Quando RFP Ara7 se fundiu com o sinal ERL1 YFP, a maioria dos punctates se sobrepôs, sugerindo que algumas moléculas ERL1 YFP foram transportadas para os MVBs.
Séries temporais de folhas verdadeiras contendo ERL1, YFP e proteína marcador MVB RFP Ara7 mostraram que endossomos marcados com YFP se moveram junto com RFP Ara7 dentro das células da linhagem estomatal. Confirmou que o YFP ERL1 estava localizado nos corpos multivesiculares.
