Comece moendo 10 miligramas de Mycobacterium paratuberculosis liofilizado em um pó fino usando uma argamassa e pilão. Adicione cinco mililitros de adjuvante Incompleto de Freund para obter uma solução estoque de 10 miligramas por mililitro. Guarde o estoque a menos quatro graus Celsius.
Antes da imunização, diluir a solução estoque. Em seguida, dilua o peptídeo MOG 35-55 para dois miligramas por mililitro e armazene-o a menos 20 graus Celsius. Misture volumes iguais do MOG 35-55 com o adjuvante em um tubo de cinco mililitros com um homogeneizador até formar uma emulsão espessa.
Após cada 10 segundos de mistura, coloque a solução no gelo por 20 segundos e gire o tubo para recuperar toda a solução. Transfira a emulsão para uma seringa de um mililitro, garantindo que ela esteja livre de bolhas de ar. Em seguida, encaixe-o com uma agulha de calibre 27.
Por via subcutânea, injetar 200 microlitros da emulsão na parte inferior das costas de um camundongo anestesiado. Em seguida, injetar intraperitonealmente uma dose de toxina pertussis no dia zero e dois após a imunização. Todos os camundongos manifestaram uma doença monofásica aguda, caracterizada por um único pico de incapacidade observado em 14 a 17 dias, seguido por uma recuperação parcial dos sintomas nos 10 dias seguintes.
Camundongos imunizados com M.paratuberculosis apresentaram início mais precoce após a imunização e maior gravidade na fase aguda. Ambos os grupos demonstraram pesos corporais semelhantes. O ensaio de proliferação com incorporação titulada de timidina realizado em células do baço de camundongos EAE mostrou forte resposta proliferativa ao peptídeo MOG 35-55, mas não à ovalbumina.
A análise citofluorométrica mostrou aumento de linfócitos T, células dendríticas e monócitos no baço de camundongos EAE imunizados com M.paratuberculosis em comparação com camundongos imunizados com CFA. A análise da hematoxilina e do tecido de eosina revelou infiltrado inflamatório mononuclear paravascular e meníngeo típico no encéfalo e na medula espinhal.
