Filtrar as proteínas brutas extraídas do intestino de Sipunculus nudus através de uma membrana filtrante de 0,22 micrômetros. Conservar esta amostra a quatro graus Celsius para utilização posterior. Embale a coluna de cromatografia de afinidade da matriz de arginina agarose carregando o meio da matriz de arginina agarose em uma coluna de cromatografia vazia de cinco mililitros.
Da mesma forma, carregue a coluna de cromatografia de afinidade da matriz de lisina agarose carregando o meio da matriz de lisina agarose em uma coluna de cromatografia vazia. Equilibrar as colunas de cromatografia de afinidade com água bidestilada seguida de tampão cloridrato de tris. Coloque a amostra de proteína filtrada na coluna pré-equilibrada.
Lavar a coluna com cinco volumes de tampão cloridrato de tris 0,02 molar antes de eluí-la com soluções de cloreto de sódio 0,15-0,25-0,35-0,45-0,55 e 0,65 molares, sucessivamente. Uma vez que o pico de eluição aparece na eluição de cloreto de sódio 0,15 molar, colete as frações em tubos de cinco mililitros. Concentrar a amostra de eluição utilizando um filtro ultracentrífugo de três quilodalton e armazenar esta amostra a menos 80 graus Celsius para utilização posterior.
Quando a solução proteica foi carregada na coluna de afinidade da matriz de arginina agarose, o pico de fluxo apareceu de aproximadamente 40 a 66 minutos. No estágio de eluição do gradiente, a eluição com cloreto de sódio 0,15 molar atingiu um pico de aproximadamente 94 a 110 minutos. Quando a solução proteica foi carregada na coluna de afinidade da matriz de lisina agarose, o pico de fluxo apareceu de aproximadamente 38 a 60 minutos.
No estágio de eluição do gradiente, a eluição com cloreto de sódio 0,15 molar atingiu o pico de 80 a 86 minutos.
