Para começar, as células HEK293A sementes em lâminas de cobertura de brilho colocadas em uma placa de 24 poços contendo DMEM de alta glicose até que se tornem 80% confluentes. No dia seguinte, passou fome nas células por duas horas na solução equilibrada de sal de Earl. Após o tratamento, aspirar o meio e adicionar 500 microlitros ou solução de formaldeído a 4% em PBS e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente para fixar as células.
Após a fixação, substituir a solução de formaldeído por 500 microlitros de PBS. Em seguida, extinguir o grupo aldeído livre adicionando 500 microlitros de solução de cloreto de amônio 50 milimolares em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. Substitua a solução de cloreto de amônio por 500 microlitros de uma solução de digitonina de 50 microgramas por mililitro em PBS por cinco minutos para permeabilizar as células.
Após a permeabilização, substitua a solução de digitonina por 500 microlitros de PBS repetindo a lavagem com PBS três vezes. Após a última lavagem, incubar as células em 500 microlitros de solução bloqueadora por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, substitua a solução de bloqueio por 500 microlitros de PBS.
Em seguida, usando pinças, colete as folhas de cobertura do poço e remova o excesso de PBS usando lenços de tecido finos. Na câmara umidificada, coloque suavemente a tampa deslizante com o lado da célula para baixo em uma gota de 50 microlitros de solução de anticorpos primários. Incubar as células em câmara umidificada durante uma hora à temperatura ambiente.
Após a incubação, recolher as lamínulas da tampa e drenar o excesso de solução de anticorpos primários. Coloque os escorregões de tampa de volta na placa de 24 poços com o lado da célula para cima e lave-os três vezes com PBS. Após a última lavagem, colete as lamínulas de tampa e escorra o excesso de PBS antes de colocar cada lamínula com o lado da célula para baixo em uma gota de 50 microlitros de solução de anticorpos secundários.
Incubar em câmara umidificada por uma hora. Após a incubação, drene o excesso de solução de anticorpos secundários e lave a lamínula três vezes com 500 microlitros de PBS na placa de 24 poços. Depois de drenar o excesso de PBS, coloque cada tampa com o lado da célula para baixo em uma gota de 50 microlitros de solução de ganchos diluída de um a 4.000 em PBS em uma câmara umedecida.
Incubar em câmara umidificada por cinco minutos. Em seguida, retire o excesso de solução de ganchos e lave as lamínulas da tampa três vezes com PBS e uma vez com água deionizada em uma placa de 24 poços. Depois de drenar o excesso de água deionizada, coloque cada tampa deslizante em uma gota de 10 a 20 microlitros de solução de montagem manchada em uma lâmina de microscópio evitando a formação de bolhas de ar.
