Comece aspirando o meio das placas contendo 264.7 bruto aderente. Adicione 10 mililitros de PBS por placa de 15 centímetros. Use um raspador de células para separar as células e puxá-las em um único tubo de 50 mililitros.
Pipetar a suspensão celular para cima e para baixo para homogeneizar. Em seguida, transfira 5% do volume da suspensão celular para um novo tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a 300G por cinco minutos à temperatura ambiente.
Descarte o sobrenadante e coloque a fração celular total em pastilha no gelo. Após centrifugar a suspensão remanescente conforme descrito anteriormente, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em cinco mililitros de tampão mitocondrial gelado. Centrifugar a suspensão a 300G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Ressuspenda o pellet em 0,5 mililitros de tampão mitocondrial frio. E transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, homogeneize a suspensão, contornando-a 30 vezes através de uma agulha calibre 25 encaixada em uma seringa de um mililitro.
Em seguida, adicione um mililitro de tampão mitocondrial frio ao tubo e misture por inversão. Depois de centrifugar as células, transfira um mililitro do sobrenadante para um tubo fresco sobre gelo. Ressuspenda o pellet no tampão e homogeneize-o passando por uma agulha de calibre 25 encaixada em uma seringa de um mililitro.
Puxe os pellets de células homogeneizadas e o sobrenadante das etapas anteriores em um único tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a 2.000G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Recolha o sobrenadante e divida em quatro tubos de 1,5 mililitros.
Completar o volume em cada tubo para 1,5 mililitros usando tampão mitocondrial. Inverta os tubos para misturar seu conteúdo e, em seguida, centrifugar os tubos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e a pastilha de celular branca superior.
Mantenha um dos quatro tubos contendo a pelota mitocondrial marrom sobre gelo como uma fração mitocondrial bruta. Puxe os pellets restantes em um novo tubo e faça o volume final de um mililitro com tampão mitocondrial. Usando este protocolo, células totais e frações mitocondriais brutas foram obtidas da linhagem bruta de 264,7 macrófagos e BMDM.
A imunoanálise sanguínea mostrou que a citrato sintase mitocondrial foi enriquecida na fração bruta. Proteínas do citosol, membrana plasmática, núcleo, lisossomo e retículo endoplasmático desapareceram. A análise do proteoma mostrou um enriquecimento de mais de dez vezes na fração bruta.
Os outros seis compartimentos celulares foram esgotados durante a purificação.
