Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

Comece colocando o tecido em uma placa de cultura de tecido estéril e removendo o excesso de meios. Meça o tecido com uma régua de metal estéril e fotografe-o. Adicione três mililitros de mídia DMEM/F-12 avançada ao tecido cortado e pipete o tecido para cima e para baixo para lavá-lo.

Em seguida, lave o lenço com três mililitros de PBS. Aspirar o meio da placa de cultura de tecidos e cortá-lo em pequenos pedaços usando lâminas estéreis e dois mililitros de meios de digestão. Em seguida, colete o tecido em um tubo de 50 mililitros contendo cinco mililitros totais do meio de digestão.

Incubar o tubo a 37 graus Celsius durante uma hora. Misture periodicamente a suspensão pipetando para cima e para baixo. Inative a tripsina adicionando cinco mililitros de DMEM/F-12 avançado ao tubo.

Em seguida, filtre a amostra através de um filtro de poros de 70 micrômetros para remover quaisquer detritos grandes. Agora pipete dois mililitros de DMEM contendo 10% FBS para o topo do filtro, e use uma pipeta para coletar os detritos e restos de tecido para cultivo de fibroblastos. Em seguida, plaquear os detritos para cultura de fibroblastos.

Centrifugar o filtrado à temperatura ambiente a 200 a 300 G durante cinco minutos e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Adicione cinco mililitros de DMF 12 avançado ao pellet e centrifugar a suspensão novamente a 300 G por cinco minutos. Para a lise de glóbulos vermelhos, ressuspenda o pellet em quatro mililitros de tampão de lise de potássio de cloreto de amônio e transfira-o para um tubo de 15 mililitros.

Incubar as células à temperatura ambiente durante dois minutos. Após centrifugar a mistura nas mesmas condições demonstradas anteriormente, aspirar o sobrenadante. Ao pellet, adicione cinco mililitros de DMEM/F-12 avançado e centrifugue novamente a quatro graus Celsius.

Após aspirar o sobrenadante, adicionar um mililitro de reagente de dissociação celular comercialmente disponível ao pellet e incubá-lo por dois a três minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, centrifugar e aspirar novamente o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de DMEM/F-12 avançado.

Dissociar aglomerados celulares pipetando a suspensão várias vezes com uma pipeta P1000. Centrifugar a suspensão e retirar o sobrenadante. Em seguida, obtenha as ponteiras de pipeta P1000 e P200 pré-resfriadas e use as pontas frias fixadas na pipeta P1000 para ressuspender o pellet de células na matriz de membrana, antes de colocar o Falcon no gelo para evitar a solidificação.

Obter a placa pré-aquecida da incubadora. Usando a pipeta P200 ajustada em 48 microlitros e usando pontas frias, crie cúpulas de matriz de membrana basal na placa pré-aquecida. Em seguida, incube-o para solidificar a mistura da membrana basal.

Uma vez solidificada a matriz, adicionar dois a dois mililitros e meio de DMEM/F-12 avançado, suplementado com os fatores de crescimento e inibidores. Células tumorais foram isoladas e organoides tumorais foram estabelecidos a partir de tecido fresco durante um período de 15 dias. Ocasionalmente, grandes volumes de debris celulares impedem a visualização precisa de organoides tumorais em desenvolvimento.

Organoides em desenvolvimento variaram fenotipicamente de culturas isoladas, arredondadas a esferoides ou agregadas, dependendo da origem do tumor. Culturas de organoides podem estar contaminadas por fibroblastos, um produto IP comum da cultura de células tumorais primárias. Após aproximadamente sete dias de cultivo, os fibroblastos migram das cúpulas da matriz da membrana basal e aderem às placas celulares, o que pode comprometer o crescimento organoide ideal.

As culturas de fibroblastos são estabelecidas a partir dos restos teciduais recuperados do filtro. As células migram para fora dos restos teciduais e aderem às placas de cultura.