Para começar, apague a luz da sala. Selecione Ocular sob o painel ocular no software FlowView. Altere a torre do cubo para quatro TRITC e desligue o controlador do painel de toque clicando em desligar sob a luz de fundo do controlador do painel de toque no software.
Em seguida, desligue a tela do computador. Abra a parte frontal da capa de pano preta no microscópio. Pegue o prato de 35 milímetros com fundo de vidro contendo os embriões da caixa preta e coloque-o no palco do microscópio.
Em seguida, ligue a unidade de iluminação de fluorescência e use a ocular para identificar o embrião de interesse. Coloque-o em foco. Feche a tampa de pano preta para proteger a amostra da luz.
Ligue a tela do computador para acessar o software que controla o microscópio. Trocar a ocular para LSM no software para aquisição das imagens. Realizar ablação a laser no controle de embriões não estimulados utilizando objetiva de imersão em água com aumento de 25 vezes.
Clique em Z brilhante, Gerenciador de sequência e estimulação LSM na janela da ferramenta. Defina o tipo de scanner como Galvano e o tamanho da varredura como 512 por 512. Ligue o canal um e o canal três sob o painel de configuração PMT para permitir o uso do laser de 1040 nanômetros e clique ao vivo quatro vezes mais rápido para visualizar o embrião.
Gire o embrião usando a função de rotação para orientar verticalmente o eixo anteroposterior e defina o zoom para três. Desenhe uma região de interesse ou ROI usando a ferramenta de forma em configurações de varredura e defina o tamanho do ROI no painel de referência. Em seguida, defina o ROI como 512 pixels de largura e 100 pixels de altura.
Para definir os parâmetros de aquisição para a pilha Z pré-ablação, registre a superfície do embrião como zero sob a seção Z. Defina o início como zero e o final como 100 micrômetros. Defina o tamanho da etapa como dois micrômetros e ative o modo de aquisição Z marcando Z na guia série.
Usando a função Z brilhante, defina a intensidade do laser de 1040 nanômetros para aumentar linearmente de 3% para 7%Salve a configuração de imagem atual como a primeira tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências. Para definir parâmetros de aquisição para o filme pré-ablação, defina uma ROI de 512 por 512 pixels perto da superfície ventral do embrião, como demonstrado anteriormente. Defina a intensidade do laser de 1.040 nanômetros para 3% Verifique o tempo e desmarque Z no painel da série.
Mantenha o intervalo como execução livre sob o painel de lapso de tempo e defina o ciclo como 10. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências. Para definir os parâmetros para a ablação a laser, defina uma região 3D imediatamente abaixo da membrana vitelina.
Defina o início da pilha Z como o plano e o final como 20 micrômetros mais profundo. Defina o tamanho do passo como 1,5 micrômetros. Ligue o canal dois e o canal quatro sob o painel de configuração PMT para permitir o uso do laser de 920 nanômetros.
Defina a intensidade do laser para 30% e defina a aquisição de imagem com o laser para uma única pilha Z dentro da região 3D definida. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências. Para definir parâmetros de aquisição para o filme pós-ablação, defina a aquisição de imagens para um filme pós-ablação de 100 quadros em um único plano Z usando os lasers de 1, 040 e 920 nanômetros.
Defina a intensidade dos lasers como 3% e 0,3% Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências. Selecione a sequência em adquirir. Altere o caminho de salvamento de dados e o nome do arquivo conforme necessário.
Clique em Pronto, aguarde até que o software inicialize o pipeline e, em seguida, clique em Iniciar para executar o pipeline. realizar ablação a laser em embriões estimulados, Definir parâmetros de aquisição para a pilha Z pré-ablação, conforme demonstrado para os embriões não estimulados. Salve a configuração atual como a primeira tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências.
Para definir parâmetros para estimulação optogenética dentro de uma ROI definida, altere o zoom para um e selecione uma ROI que cubra a superfície ventral do embrião. Desligue o canal um para canalizar quatro detectores, clique em estimulação LSM, desmarque contínuo dentro da duração e digite 12 segundos. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em estimulação no Gerenciador de sequências.
Estabeleça um tempo de espera de três minutos após a estimulação para garantir a inativação total da miosina e a desmontagem apical da F-actina e alcançar uma morfologia tecidual estática antes da ablação a laser. Em seguida, defina parâmetros de aquisição para o filme pré-ablação no plano Z único, como demonstrado para os embriões não estimulados, exceto que os lasers de 1, 040 e 920 nanômetros são usados para aquisição de imagens. Ligue o canal um para canalizar quatro detectores.
Defina a intensidade dos lasers como 3% e 0,3% Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências. Definir parâmetros para ablação a laser como demonstrado para os embriões não estimulados. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências.
Definir parâmetros de aquisição para o filme pós-ablação no plano Z único, como demonstrado para os embriões não estimulados. Salve a configuração atual como a próxima tarefa do pipeline clicando em LSM no Gerenciador de Sequências. Selecione a sequência em adquirir.
Altere o caminho de salvamento de dados e o nome do arquivo conforme necessário. Clique em pronto e aguarde até que o software inicialize o pipeline e, em seguida, clique em Iniciar para executar o pipeline. Nos embriões não estimulados submetidos à constrição apical, o espaguete mCherry de abóbora ficou enriquecido na região apical medial, enquanto o CRY2Rho um mCherry negativo dominante foi citosólico.
Nos embriões estimulados, o sinal mCherry negativo dominante do CRY2Rho tornou-se localizado na membrana plasmática, enquanto o sinal apical medial da abóbora mCherry desapareceu completamente. A ablação a laser dos embriões não estimulados dentro do domínio de constrição levou a um rápido recuo tecidual ao longo do eixo anteroposterior, enquanto a ablação a laser nos embriões estimulados não resultou em recuo tecidual perceptível. A ablação foi quantificada e mostrada aqui.
