Para iniciar o isolamento e normalização de proteínas reticuladas contendo DNA, aspirar o meio usando uma pipeta de aspiração após o tratamento medicamentoso com ubiquitilação e SUMOilação. Enxaguar as células com PBS gelado antes de adicionar 600 microlitros de reagente DNAzol. Agite lentamente a placa em uma plataforma vibratória por 10 minutos a quatro graus Celsius e adicione 0,3 mililitros de etanol 100% frio diretamente à placa.
Repita a agitação até que o agregado opaco de ácido nucleico se torne visível. Em seguida, transfira o lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrífuga por 15 minutos a quatro graus Celsius a 20.000 G.Após aspirar o sobrenadante, lave o ácido nucleico e a pastilha de proteína reticulada em um mililitro de etanol a 75%, seguido por dois minutos de centrifugação a 20.000 G e quatro graus Celsius. Aspirar o sobrenadante antes de girar para baixo na mesma velocidade e remover o líquido restante usando uma pipeta P-20.
Seque o pellet ao ar por cinco minutos. Dissolva o pellet de ácido nucleico seco em 0,1 mililitros de água bidestilada pipetando para cima e para baixo algumas vezes. Em seguida, incube a suspensão a 37 graus Celsius em banho-maria por 30 minutos até que o pellet inche pelo menos três vezes.
Sonicar as amostras por 10 segundos usando uma sonda de processador ultra-sônico a 30% de amplitude e quantificar a concentração de DNA usando um espectrômetro UV-Vis. Adicione água bidestilada para ajustar a concentração do DNA para 400 a 500 nanogramas por microlitro em 120 microlitros. Em seguida, transfira 20 microlitros da amostra para um novo tubo de microcentrífuga como controle de carga de DNA não digerido.
Adicionar 2.000 unidades de gel de nuclease microcócica e 11 microlitros de tampão de reação nuclease microcócica de cálcio 10X ao DNA, dissolvidos nos 100 microlitros restantes de água bidestilada. Incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos.
