Para começar a inocular 2 milhões de células pan02 em 12 mililitros de DMEM, e incubar a 37 graus Celsius e 95% de umidade, 5% de dióxido de carbono e 35% de ar. Após 48 horas, centrifugar a cultura a 28 g por 2 minutos e descartar o sobrenadante. Fixe as células adicionando 1 mililitro de glutaraldeído a 2,5% nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro durante a noite a 4 graus Celsius.
No dia seguinte, centrifugar as amostras a 1006 g por cinco minutos e aspirar o fixador antes de enxaguar a amostra duas vezes com PBS 0,1 molar. Em seguida, enxaguar as amostras duas vezes com água bidestilada por 10 minutos cada. Em seguida, adicione uma solução de 50 microlitros de tetróxido de ósmio a 1% e ferrocianeto de potássio a 1,5% na proporção de 1 para 1 e incube a 4 graus Celsius por 1 hora.
Centrifugar e enxaguar as amostras duas vezes com PBS 0,1 molar e uma vez com água bidestilada. Em seguida, adicione 1 mililitro de tiocarboidrazida a 1% e incube à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Após incubação, centrifugar e descartar o sobrenadante antes de enxaguar as amostras 4 vezes com água bidestilada.
Em seguida, adicione 50 microlitros de tetróxido de ósmio a 1% e deixe fixar à temperatura ambiente por 1 hora. Centrifugar novamente e enxaguar as amostras 4 vezes com água bidestilada. Adicione 1 mililitro de acetato de uranila a 2% e deixe manchar a 4 graus Celsius durante a noite.
Depois de enxaguar as amostras com água bidestilada adicione 1 mililitro de solução de Walton e incube a 60 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, enxaguar as células 4 vezes com água bidestilada antes da desidratação em uma série graduada de etanol por 10 minutos cada. Em seguida, desidrate duas vezes em um mililitro de 100% acetona por 10 minutos cada.
Em seguida, misture 200 microlitros de acetona com a resina epóxi Pon 812 na proporção de 3 para 1, 1 para 1 e 1 para 3. E deixar as amostras de molho na resina à temperatura ambiente por 2, 4 e 4 horas, respectivamente, após a respectiva incubação, impregnar as amostras durante a noite em resina epóxi 100%Pon 812. No dia seguinte, transfira os espécimes para um molde de incorporação plano e polimerize-os em um forno a 60 graus Celsius por 48 horas.
Após a polimerização, usando um ultramicrótomo, colete tiras fatiadas em série de 70 nanômetros de espessura nos wafers de silício hidrolisados e seque-os em forno de 60 graus Celsius por 10 minutos.
