Corte uma fita condutora de carbono e cole-a entre os wafers de silício montados com seções de células pancreáticas e o estágio da amostra de MEV. Em seguida, ajuste a tensão de aceleração FESEM para dois quilovolts com uma distância de trabalho de quatro milímetros. Na barra de menu superior, clique no ícone HL.
Em seguida, em baixa ampliação, oriente a primeira seção das tiras de fatia de destino e, novamente, clique no ícone HL para alternar para o modo de alta ampliação. Colete uma imagem apropriada para a estrutura de interesse ajustando o brilho, o contraste e a ampliação da imagem. Em seguida, selecione Exibição de projeto, Abrir dados e importe os arquivos de imagem a serem analisados para o software.
Alinhe as imagens clicando em Alinhar fatias e Editar. Em seguida, na barra de menus inferior esquerda, ajuste o valor Intervalo de intensidade modificando a transparência da imagem. Selecione o módulo Extrair Subvolume e clique nos conjuntos de dados alinhados para ajustar o tamanho da parte sobreposta de toda a pilha.
Em seguida, na subseção segmentação, selecione Reamostrar, depois Segmentação e clique em Salvar. Em seguida, escolha o limite da Varinha Mágica e o tamanho da Ferramenta Pincel para selecionar o intervalo correto. No menu Seleção, clique no ícone Adicionar para adicionar a área selecionada.
Depois de concluir a segmentação regional, gere um arquivo de imagem seguindo os melhores resultados para o tamanho do objeto e resolução da imagem. Clique em Cortar Editor e, na caixa Controle Deslizante Virtual, digite o número seis. Em seguida, no menu suspenso esquerdo, clique com o botão direito do mouse na área cinza sob a subseção Projeto e selecione Gerar superfície e, em seguida, Criar e aplicar.
No arquivo gerado, usando o módulo Surface View, crie a estrutura da superfície e a representação 3D. As imagens de MESEM 2D revelam que, no grupo controle, as mitocôndrias estavam uniformemente distribuídas com estruturas de cristas regulares. Em contraste, o grupo RSL3 mostrou mitocôndrias encolhidas com aumento da densidade de membrana e estruturas de cristas vagas.
No entanto, nem todas as cristas mitocondriais degeneraram no grupo RSL3, pois algumas permaneceram intactas. Em comparação com o grupo RSL3, o grupo inibidor tinha principalmente estruturas de cristas intactas, com apenas algumas não aparentes. As imagens 3D do grupo controle forneceram uma visão mais precisa das mitocôndrias e suas cristas.
As imagens 3D do grupo RSL3 mostraram mitocôndrias irregulares e vacuolizadas, enquanto o grupo inibidor exibiu diversas formas de cristas. A quantificação das alterações mitocondriais mostrou que o grupo RSL3 apresentou diminuição significativa do comprimento e volume mitocondrial, comparado ao grupo controle, enquanto o grupo inibidor apresentou resultados intermediários. O RSL3 também causou disfunção mitocondrial e alterou o metabolismo celular, alterando a morfologia mitocondrial e desencadeando ferroptose.
