Para começar, coloque os camundongos anestesiados na plataforma cirúrgica. Depois de aparar o cabelo, aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar que eles sequem. Em seguida, fixe os ratos em um aparelho estereotáxico para imobilização.
Faça uma pequena incisão sob um microscópio para expor totalmente o crânio. Prepare duas seringas de 10 microlitros, uma contendo shRNA do receptor AAV2/5-adenosina 2A e a outra contendo AAV2/5 scramble. Em seguida, use o microscópio para localizar o bregma e lambda e defina o ponto de coordenadas na seringa de 10 microlitros com base no atlas estereotáxico cerebral de camundongos.
Faça um pequeno orifício no crânio no ponto de coordenação estabelecido. Injetar dois microlitros do vírus shRNA do receptor AAV2/5-Adenosina 2A no ventrículo cerebral através de injeção lateral a uma taxa constante de 100 nanolitros por minuto. Mantenha a agulha no lugar por 10 minutos antes de retirar.
Sele a pele lesionada prontamente usando cola de biofibrina médica para evitar a perda de vírus. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento, mantendo sua temperatura corporal aproximadamente em 37 graus Celsius para facilitar a recuperação. Injetar dois microlitros de CRE-TAT Recombinase em cada ventrículo lateral de camundongo tomateiro Arosa L-D-L-T-D para o grupo experimental, e dois microlitros de PBS estéril para o grupo controle.
Duas semanas após a injeção da CRE-TAT Recombinase, preparar cortes de tecido congelado, realizar coloração nuclear e preparar a lâmina para exames de imagem A derrubada do receptor de adenosina 2A no plexo coroide em camundongos homozigotos com fluxo de receptor de adenosina 2A, usando CRE-TAT, levou à diminuição dos escores clínicos do EAE. Da mesma forma, derrubar o plexo coroide em camundongos selvagens do receptor de adenosina 2A, usando AAV2/5 shRNA, diminuiu os escores clínicos do EAE. A análise da QPCR mostrou que os níveis de RNAm do receptor de adenosina 2A diminuíram nos grupos shRNA AAV2/5 e CRE-TAT, comparados a cada controle.
O silenciamento do receptor de adenosina 2A, especificamente no plexo coroide, reduziu a infiltração de células imunes na medula espinhal.
