Para começar, borrife o animal eutanasiado com etanol 70%. Usando uma tesoura grande, faça uma incisão horizontal ao nível do abdômen do lado esquerdo para o direito do corpo do animal e corte ao redor da cintura. Puxe a pele dos membros posteriores para revelar os músculos.
Coloque o animal sobre uma placa de cortiça coberta de papel alumínio e fixe um membro anterior e o membro posterior oposto. Trabalhando rapidamente, remova todos os músculos dos membros posteriores anterior e posteriormente, em seguida, remova qualquer fáscia, gordura, tecido nervoso e cabelo. Em seguida, coloque os músculos em uma placa de Petri de 10 centímetros colocada no gelo e adicione DMEM ao prato para manter os músculos úmidos.
Depois de cortar os músculos para um homogeneizado liso, transfira o homogeneizado para um tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de mistura de digestão. Para evitar que o conteúdo vaze, envolva as bordas da tampa do tubo fechado com filme flexível. Coloque o tubo em banho-maria agitado a uma velocidade baixa a média e 37 graus Celsius.
Depois de agitar por uma hora, misture a suspensão de tecido pipetando-a suavemente para cima e para baixo sete vezes usando uma pipeta de 10 mililitros para obter uma mistura homogênea. Aplique uma nova película ao redor da tampa após tampar o tubo e coloque-a de volta no banho de água agitada por uma hora para completar a digestão do tecido. Em seguida, encha o tubo de digestão contendo o tecido digerido até a marca de 50 mililitros com DMEM suplementado a frio.
Misture o conteúdo invertendo o tubo três vezes. Coloque um filtro de células de 100 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros. Passe a mistura digerida através do filtro de células para o novo tubo e, em seguida, centrifugar a mistura a 600 G e quatro graus Celsius durante cinco minutos.
Descarte o supinatent em um recipiente de resíduos líquidos. Depois de ressuspender o pellet em um mililitro do antibiótico frio suplementado DMEM, encha o tubo para 50 mililitros com o mesmo DMEM. Passe a mistura ressuspensa através de um filtro de células de 70 mícrons para outro tubo novo e, em seguida, centrifugue o tubo novamente em baixa velocidade.
Passe o supinatent através de um filtro de células de 40 mícrons para um novo tubo centrífugo de 50 mililitros. Depois de centrifugar a mistura, descarte o supinatent em um recipiente de resíduos líquidos. Em seguida, trabalhando sob o capô de cultura, ressuspenda o pellet em FBS.
Para o cultivo, ressuspender 1/32 da suspensão celular em 400 microlitros de meio de cultura por poço em uma placa de oito poços revestida com gel matricial. Incubar as culturas por 10 dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Troque o meio diariamente após a mudança da cultura para uma cor amarelada.
A coloração de anticorpos de massa muscular cultivada de camundongos selvagens e camundongos repórteres mostrou células miogênicas e de nicho após sete dias em cultura. A dupla coloração com PAX7 e Ki67 revelou que as células de reserva apareceram após cinco dias em cultura e apresentavam características de células-tronco musculares. A dupla coloração com miosina de cadeia pesada, ou MYHC, e miogenina mostrou que as células que avançaram através da diferenciação muscular expressaram progressivamente MYOG e então se fundiram para formar tubos de mio multinucleados positivos para MYHC.
A coloração com CD31, ou PDGFR Alfa, revelou células de nicho como células endoteliais e progenitores fibroadipogênicos, ou FAPS. Células de reserva emergentes foram marcadas pela proteína verde de fluorescência, ou GFP. A co-coloração com GFP e NYHC permitiu avaliar a posição das células quiescentes dentro da cultura.
A co-coloração com GFP e outros marcadores de ativação ou diferenciação revelou a natureza quiescente das células de reserva.
