Para realizar imagens de células vivas do cérebro de larvas de terceiro ínstar, comece coletando os cérebros dissecados e os corpos gordurosos isolados no último poço de uma placa de dissecção de três poços contendo a dissecção e o meio de imagem. Coloque uma membrana permeável a gás na parte de trás de uma lâmina e pressione o anel dividido no centro. Usando uma micropipeta de 200 microlitros, transfira até 10 cérebros dissecados com o máximo possível de corpos gordurosos e 130 a 140 microlitros do meio para o centro da membrana.
Orientar os cérebros de acordo com a população de células-tronco neurais a serem fotografadas e o tipo de microscópio, garantindo que as amostras estejam próximas ao objetivo do microscópio. Por exemplo, para obter imagens de células-tronco neurais nos lobos cerebrais centrais, certifique-se de que os lobos cerebrais estejam mais próximos do objetivo. Em seguida, coloque suavemente uma tampa de vidro deslizante sobre a solução na membrana para espalhar a solução com o cérebro e os corpos gordurosos por toda a membrana.
Segure o tecido de laboratório na borda deslizante da tampa para manchar o excesso de solução até que os cérebros toquem a tampa deslizar sem ser esmagado. Em seguida, imobilize a geleia de cobertura aplicando vaselina derretida ao longo de suas bordas usando um pincel e deixe a geleia solidificar. Adicione 400 microlitros de meio de imagem a um poço em uma micro lâmina de vários poços.
Transfira os corpos gordurosos previamente dissecados para este poço. Em seguida, coloque até 10 cérebros em um aglomerado perto do centro do poço. Orientar os cérebros de acordo com a população de células-tronco neurais a ser fotografada e o tipo de microscópio.
Deixe os cérebros se acomodarem no poço por dois a cinco minutos. Cubra a microlâmina com a tampa da lâmina antes de transferi-la para o microscópio. Inicie o processo de aquisição usando a menor potência do laser e tempo de exposição para minimizar o fotoclareamento.
Imagens de cérebros larvais expressando Cherry-Jupiter impulsionado por UAS e pinos andróginos marcados GFP usando lâminas de imagem de vários poços e sem suplementação de corpo gorduroso revelaram que os pinos formaram um crescente apical pronunciado em neuroblastos em divisão aos quais os fusos mitóticos consistentemente se alinharam durante a mitose. Nessas amostras, o comprimento do ciclo celular aumentou com o aumento do tempo de imagem. As amostras que foram fotografadas em um meio suplementado de corpo gorduroso em uma lâmina ligada à membrana não mostraram um aumento no comprimento do ciclo celular.
Além disso, neuroblastos com quatro divisões foram observados na lâmina de 10 horas ligada à membrana.
