Para começar, pegue o cérebro isolado dos filhotes de camundongos sacrificados e coloque-o em uma placa de Petri de três centímetros contendo MEM frio com EBSS e 2X PSN. Sob um escopo de dissecação, separe os hemisférios cerebrais, remova e descarte o mesencéfalo, o hipocampo e as meninges. Coloque os dois hemisférios corticais em um tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco mililitros de MEM EBSS com 2X PSN e mantenha no gelo.
Em uma capa de cultura de tecidos, aspire o meio do tubo cônico de 50 mililitros usando uma pipeta, deixando os pedaços de tecido cortical na parte inferior. Adicione 10 mililitros de meios de dissociação pré-aquecidos com uma pipeta de vidro revestida e triture o tecido 10 a 20 vezes. Transfira a suspensão para um copo de 50 mililitros contendo uma pequena barra de agitação e coloque-a em uma placa de agitação.
Em seguida, remova o copo, coloque-o em um ângulo de 30 graus por três minutos para permitir que o tecido assente e transfira a suspensão celular para um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Centrifugue o tubo cônico de 50 mililitros a 1000G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Substitua o sobrenadante por meio de crescimento glial e conte as células usando um hemocitômetro.
Plaquear as células a uma densidade de um milhão em placas tratadas com cultura de células de 10 centímetros e incubar por 24 horas. Em seguida, substitua o meio por meio glial fresco e deixe as células atingirem 100% de confluência dentro de duas semanas antes de colocá-las em placas para experimentação. Placa 100, 000 células gliais por poço em placas de seis poços e permite que elas atinjam 80% a 100% de confluência para infecção por príon in vitro.
Exponha homogeneizados cerebrais diluídos a 20% e PBS à luz ultravioleta por 30 minutos. Aspire o meio da glia a ser infectada e adicione 1,5 a 2 mililitros de meio de crescimento glial com 0,1% de homogeneizado cerebral normal ou príon por poço. Após 72 horas, remova o meio, lave as células com PBS e adicione meio de crescimento glial fresco.
Aspirar cuidadosamente o tecido adiposo em aproximadamente um mililitro de HBSS em solução de tripsina a 0,25%, usando uma pipeta sorológica. Transfira o tecido para uma placa de Petri de quatro centímetros contendo dois mililitros de mídia DMEM F-12 com Dnase-1, colagenase e mistura Dispase. Em seguida, corte o tecido adiposo em pedaços pequenos usando uma tesoura e incube a mistura a 37 graus Celsius por 1,5 horas.
Transfira o tecido para um tubo cônico de 50 mililitros, triture o tecido e coloque a fração vascular estromal, que ficará vermelha. Depois de lavar o pellet com PBS estéril e centrifugar por três minutos, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio ADMSC. Em seguida, pipetar a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo cônico estéril de 50 mililitros, para remover o tecido não dissociado.
Adicione nove mililitros de meio ADMSC a um prato tratado com cultura de células de 10 centímetros. Pipete a suspensão celular tensa e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque o meio no dia seguinte e passe as células assim que atingirem 80% a 90% de confluência.
Depois que as células passarem por duas a três passagens, ressuspenda-as em três a 10 mililitros de meio e conte usando um hemocitômetro. Coloque 100.000 células por poço em placas de seis poços contendo meio ADMSC e incube durante a noite, conforme mostrado anteriormente. No dia seguinte, prepare o meio ADMSC para células estimuladas por citocinas com 10 nanogramas por mililitro de TNF-alfa ou 200 nanogramas por mililitro de IFN-gama.
Crie meios ADMSC com uma concentração final de 0,1% de homogeneizado cerebral normal ou infectado por príons para amostras de controle. Aspire a mídia antiga, adicione 1,5 mililitros de citocina ou mídia contendo homogeneizado cerebral nos poços correspondentes em triplicata e devolva as placas à incubadora. Em seguida, lave as células com PBS e isole o RNA adicionando 350 microlitros de tampão de lise com 1% de beta-mercaptoetanol a cada poço.
Remova os lisados celulares usando um levantador de células e transcreva reversamente 25 nanogramas de RNA por amostra e amplifice o DNA complementar. Placa BV2 microglia a 50.000 células por poço ou glia mista primária a 100.000 células por poço em uma placa de seis poços. Trate as células BV2 com meios contendo 0,1% de homogeneizado cerebral normal ou infectado por príons e incube por 72 horas.
Após a incubação, lave as células duas vezes com PBS para remover o homogeneizado cerebral restante. Adicione meio fresco às células e retorne a placa à incubadora. Para estimular ADMCs, trate-os com 10 nanogramas por mililitro de TNF-alfa por 24 horas antes de co-cultivá-los com BV2 ou glia mista.
Lave os ADMCs estimulados com PBS três vezes e gire a suspensão ADMSC conforme demonstrado anteriormente. Substitua o meio nas células BV2 ou glia mista por dois mililitros por poço de meio ADMSC e coloque inserções para placas de seis poços com um tamanho de poro de 0,4 micrômetros na metade dos poços. Adicione dois mililitros de mídia ADMSC a cada inserção e adicione mais dois mililitros de mídia aos poços que não recebem inserções.
Após a peletização, ressuspenda e conte os ADMCs, adicione 50.000 a 100.000 células a cada inserção e incuba-as. No final da incubação, remova e descarte as inserções ou substitua-as em uma nova placa de seis poços e lave as inserções duas vezes com PBS. Adicione o tampão fornecido pelo kit de isolamento de RNA às células mistas da glia ou BV2 e raspe os poços.
