Comece preparando todos os reagentes antes do experimento e descongele a matriz da membrana basal no gelo. Em seguida, prepare o meio monocamada murino. Diluir a membrana basal descongelada de um a 20 com o meio monocamada murino frio e mantê-lo no gelo.
Coloque uma pastilha de cultura de células transparente de 0,4 micrômetros, usando pinças estéreis, em um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Pegue um pino de canto da pastilha e transfira-a para o poço. Repetir até que o número apropriado de inserções de cultura celular esteja disponível para cultura.
Para cobrir a superfície apical de cada inserção de cultura celular com matriz de membrana basal diluída, coloque a ponta da pipeta P 200 no centro da pastilha e expulse a matriz de 150 microlitros. Em seguida, transfira a placa para uma incubadora estéril de 37 graus com dióxido de carbono a 5%, por pelo menos uma hora. No final da incubação, gire a placa de 24 poços em um ângulo de 45 graus.
Coloque um único dedo no canto da pinça para estabilizar a inserção. Coloque delicadamente a ponta da pipeta P 200 ao longo do lado inferior da pastilha e remova a matriz do porão. Remova qualquer resíduo em excesso lavando cada pastilha de cultura celular com 150 microlitros de DPBS estéril sem íons cálcio ou magnésio e deixe-os secar em um armário de segurança biológica por um mínimo de 10 minutos.
Depois de secas, adicione 400 microlitros do meio monocamada murino ao fundo e 75 microlitros em cima da pastilha de cultura celular. Repita até que todas as inserções de cultura celular estejam imersas. Deixe a placa no armário de segurança biológica ou na incubadora até que seja necessário.
Em seguida, remova a placa de 24 poços de colonoides intestinais maduros da incubadora e coloque-a sob o armário de segurança biológica. Aspirar o meio usando pontas estéreis e lavar bem cada um com um mililitro de DPBS estéril à temperatura ambiente. Usando pontas estéreis, remova o DPBS sem íons cálcio ou magnésio.
Digerir cada plugue da matriz da membrana basal adicionando 500 microlitros de reagente de dissociação enzimática em cada poço a ser passado. Para quebrar o plugue, gire a placa de 24 poços em um ângulo de 45 graus. Coloque a ponta da pipeta na borda do plugue e desaloje-a suavemente, pipetando cada plugue aproximadamente seis a 10 vezes.
Coloque a placa de 24 poços de volta em uma incubadora estéril a 37 graus com dióxido de carbono a 5%, por três a quatro minutos. Após a incubação, pipetar a tripsina para cima e para baixo cinco a sete vezes para cada poço sob um armário de segurança biológica. Transfira os colonoides dissociados de cada poço para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e leve até um volume de 10 mililitros com um meio de lavagem de rato gelado.
Em seguida, centrifugar os colonóides parcialmente digeridos a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de balde oscilante. Sob o armário de segurança biológica, remova o sobrenadante do pellet usando uma pipeta de 10 mililitros. Além disso, remova qualquer meio restante usando uma pipeta P 200.
Em seguida, ressuspenda o pellet colonóide adicionando 75 microlitros de meio monocamada murino. Dispensar 75 microlitros da suspensão colonóide ao centro de cada pastilha de cultura celular. Pipetar suavemente a suspensão uma ou duas vezes antes de adicioná-la ao poço para garantir um revestimento uniforme.
Colocar a placa de 24 poços com pastilhas de cultura celular em uma plataforma giratória por 10 minutos para permitir uma dispersão uniforme através da inserção de cultura celular, antes de colocar a placa em uma incubadora estéril de 37 graus Celsius em estufa de dióxido de carbono a 5%. Ao final da incubação, desalojados os fragmentos de colonóides não aderidos, colocando-se a ponta ao lado do interior da cultura celular e pipetando-se o meio de três a cinco vezes com uma pipeta P 200. Evite interromper as células intestinais anexadas.
Retire imediatamente a mistura do meio e do colonóide. Repita até que todas as pastilhas de cultura celular tenham sido limpas. Agora adicione 150 microlitros de meio monocamada murino pré-aquecido ao lado apical de cada inserção de cultura celular.
Adicione 400 microlitros de meio monocamada murino aquecido a cada poço de uma nova placa de 24 poços. Transfira a pastilha de cultura celular para a nova placa agarrando sua pinça usando pinça estéril. Troque o meio a cada dois dias até que a confluência desejada seja atingida.
Os colonóides enzimaticamente rompidos plaqueados nas inserções de cultura celular apareceram inicialmente em aglomerados celulares que variavam de 15 a 150 células. No terceiro dia, as células achataram-se e cobriram lentamente a inserção da cultura celular, geralmente atingindo confluência. Nos dias seguintes, as monocamadas continuaram a crescer e formaram uma barreira contínua que pode ser medida quantitativamente.
