Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro sobre gelo, combine 10 microlitros do extrato livre de células com quatro microgramas de DNA plasmidial e 25 microlitros de tampão de síntese proteica livre de células 2X. Completar até um volume total de 50 microlitros com água bidestilada para preparar a solução de síntese proteica livre de células. Pese 0,75 gramas de agarose e adicione-a a 100 mililitros de tampão de água bidestilada para preparar 0,75% de agarose.
Leve ao micro-ondas a 0,75% de agarose em rajadas de 30 segundos em alta potência e pipete 50 microlitros da agarose derretida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro ou em moldes de forma desejada. Coloque a agarose derretida em um bloco de calor regulado para 50 graus Celsius e deixe a agarose esfriar, mas não polimerizar. Em seguida, misture a agarose derretida com a solução de síntese proteica livre de células pipetando e mexendo com a ponta da pipeta.
Deixe os géis arrefecerem até à temperatura ambiente e polimerizem durante aproximadamente dois minutos. Transfira a agarose polimerizada para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro com espátula e congele rapidamente em nitrogênio líquido. Coloque os hidrogéis congelados em um armazenamento de 80 graus Celsius negativos por uma hora.
Depois disso, remova as tampas do tubo de microcentrífuga. Cubra os tubos com uma película de cera e perfure a película para permitir que a umidade seja seca. Ajuste a temperatura do liofilizador para menos 20 graus Celsius e pressão para 0,1 milibar e liofilize os dispositivos de síntese de proteínas livres de células por 18 horas ou durante a noite.
Reidratar os dispositivos liofilizados por 30 minutos com 50 microlitros de água bidestilada sem excesso de líquido e transferir os géis para uma placa preta de microtitulação de 384 poços usando uma espátula. Finalmente, coloque a placa de microtitulação em um leitor de placas e use as configurações do leitor de placas mostradas na tela para detecção e análise de fluorescência. A síntese proteica livre de células de eGFP e mCherry em um hidrogel usando lisados celulares de E.coli é mostrada nesta figura.
Géis de agarose a 0,75% foram preparados sem molde de DNA com quatro microgramas de eGFP ou mCherry ou com quatro microgramas de ambos eGFP e mCherry template. Uma sobreposição dos dois canais também é mostrada, e a sobreposição inclui a imagem de contraste de interferência diferencial. Os resultados confirmaram a co-expressão de mCherry e eGFP em agarose.
