Após clonar o gene de interesse no ITR adenoassociado contendo plasmídeo, seme três vezes 10 a quinta células em uma placa de seis poços usando DMEM pré-aquecido suplementado com 10% de SFB. Permitir que as células cresçam a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para atingir 75 a 90% de confluência. Em seguida, dissolva 100 miligramas de cloridrato de polietilenimina ou PEI max em 100 mililitros de água destilada para fazer um micrograma por microlitro de estoque.
Ajustar o pH para 7,1 utilizando hidróxido de sódio. Em seguida, esterilize a mistura usando um filtro de 0,22 micrômetro e armazene o reagente por um mês a quatro graus Celsius. Em um tubo de dois mililitros, adicione 1,3 micrograma de rep/cap de plasmídeo, 1,3 micrograma de ITR contendo plasmídeo e 2,6 microgramas de plasmídeo auxiliar de adenovírus ao DMEM livre de soro.
O volume total dessa mistura deve ser de 100 microlitros. Prepare um controle negativo em um tubo separado, substituindo o plasmídeo rep/cap por um plasmídeo não relacionado. Agora adicione 5,2 microlitros de PEI max à mistura de plasmídeos.
Isso mantém uma proporção de plasmídeo para PEI igual. Vórtice suavemente 10 a 15 vezes em um misturador de vórtice ajustado para sete. Para vetores múltiplos, escalone a adição de PEI em intervalos de um minuto por tempo suficiente nas etapas subsequentes.
Incubar cada tubo durante exactamente 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, diluir a reação adicionando 1,9 mililitros de DMEM livre de soro para atingir um volume final de dois mililitros. Pipetar suavemente duas vezes para misturar o conteúdo.
Aspirar meios do poço. Adicione cuidadosamente a mistura de PEI plasmidial nas laterais do poço para evitar o desprendimento celular e incube as células por 72 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, congele a placa de células transfectadas por 30 minutos a 80 graus Celsius negativos e descongele por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Repita o ciclo um total de três vezes. Em uma capela de fluxo laminar, misture assepticamente cada poço por pipetagem para interromper as células de forma eficaz. Transfira o lisado para um tubo de dois mililitros.
Centrifugar a 15.000 G durante 15 minutos à temperatura ambiente para remover os restos celulares e transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros e armazenar o tubo a quatro graus Celsius. Em seguida, plaquear o tipo celular desejado em uma placa de 96 poços e incubar para uma confluência alvo de 50 a 75%, dependendo da duração da transdução. No dia seguinte, realizar uma série de uma a três diluições da preparação bruta em meio livre de soro para obter a quantidade ideal de vetor necessária para a transdução.
Em seguida, aspirar o meio da placa de 96 poços e adicionar 50 a 100 microlitros de preparação bruta diluída aos poços. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para determinar a eficiência da transdução, observar a expressão do repórter fluorescente utilizando um microscópio fluorescente 48 horas pós-transdução.
Para análise adicional, remova o vetor e lave as células uma vez com PBS pré-aquecido. Finalmente, finalizar a transdução fixando as células em paraformaldeído a 4% por 10 minutos. Os dados de eficiência de transdução sugeriram que AAV2 e KP1 foram os sorotipos mais potentes em todas as linhagens celulares testadas.
O HEPA1-6 exibiu uma diminuição acentuada na transdução em comparação com Huh7. AAV2 transduziu eficientemente mioblastos indiferenciados de HSKMC e miotubos HSKMC diferenciados. Diferentes condições de meios desempenham um papel importante durante a transdução.
Organoides do intestino delgado de camundongos cultivados em meios pré-transdução foram transduzidos de forma menos eficaz em comparação com aqueles cultivados em meios de crescimento organoides.
