Comece posicionando um camundongo eutanasiado para enucleação ocular usando pinças curvas para pressionar o tecido ao redor do olho para deslocar o olho para fora do alvéolo. Em seguida, levante e remova o olho e transfira-o para PBS fresco na bandeja de dissecção. Usando tesouras ultrafinas, corte o nervo óptico o mais próximo possível do globo ocular e insira cuidadosamente uma pinça reta de ponta fina no globo ocular através da saída do nervo óptico na parte posterior do olho.
Agora, insira uma tesoura na parte posterior do olho e comece a fazer uma incisão da parte posterior em direção à junção escleral da córnea, e continue a incisão até que metade da junção tenha sido separada. Empurre suavemente a córnea para que a lente possa sair pela incisão. Usando pinças retas de ponta fina, remova cuidadosamente qualquer pedaço grande de tecido da lente.
Depois de encontrar a região equatorial, perfure superficialmente a lente e, em seguida, remova a cápsula da lente. Transfira as células de fibra da lente para um prato de 60 milímetros com paraformaldeído a 1%. Usando um bisturi afiado, divida a bola das células fibrosas ao meio ao longo de seu eixo anteroposterior.
E depois cortar ainda mais as metades ao longo do mesmo eixo para produzir quartos. Use a pinça reta para remover a região do núcleo do quarto da célula de fibra da lente. Em seguida, adicione 200 microlitros de paraformaldeído a 1% a uma placa de 48 poços.
Transfira o córtex da lente para a placa e incube por 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave a 300 RPM. Após o bloqueio, adicione anticorpos primários apropriados à placa de 48 poços e transfira as amostras para a solução de anticorpos primários. Incubar as amostras durante a noite a 4 graus Celsius com agitação suave ou mutação.
No dia seguinte, lavar as amostras com PTX e, da mesma forma, incubá-las com anticorpos secundários. Depois de lavar as amostras, adicione uma gota ou 50 microlitros de mídia de montagem em uma lâmina de microscópio mais carregada. Coloque o tecido no meio de montagem.
E use pinças para separar suavemente as células de fibra umas das outras. Em seguida, coloque delicadamente uma tampa em cima das células separadas e da mídia de montagem. Depois de remover o excesso de meios, use esmalte para selar as bordas da tampa deslizante na lâmina antes da microscopia confocal.
Após a dissecção da lente e a remoção da cápsula da lente, transfira a massa de células de fibra para as pontas dos dedos enluvadas molhadas e role suavemente em todas as direções para separar o núcleo da lente. Em seguida, transfira o núcleo da lente para uma solução de paraformaldeído a 1% recém-feita em uma placa de 48 poços e incube durante a noite a 4 graus Celsius com agitação suave ou mutação. No dia seguinte, transferir a amostra para uma placa de 60 milímetros com paraformaldeído a 1% e usar um bisturi afiado para dividir o núcleo do cristalino ao longo do eixo anteroposterior ao meio e, em seguida, em quartos.
Em seguida, pós-fixe, bloqueie, core e monte a amostra como demonstrado anteriormente Nessas preparações, feixes de células de fibras do cristalino com morfologias únicas são encontrados em diferentes regiões do cristalino. A coloração da rede F-actina mostra enriquecimento na membrana celular em fibras diferenciadoras e maduras, enquanto sinais de F-actina estão presentes no citoplasma de fibras nucleares. A microscopia eletrônica de varredura e as imagens confocais das células diferenciadoras das fibras mostram interdigitações de esferas e cálices com pequenas saliências interligadas, enquanto as fibras maduras têm pás decoradas por pequenas saliências.
Imagens de microscopia eletrônica de varredura e microscópio confocal de células de fibras nucleares do cristalino revelam saliências interligadas infrequentes e maiores nos lados curtos das células, onde a membrana celular é rugosa e tem interdigitações de língua e sulco nessas células a partir do centro do cristalino.
