Para começar, use equipamentos de proteção individual, incluindo proteção ocular, máscara cirúrgica e luvas sem látex. Preparar 20 mililitros de neuroblastoma de camundongo ou células BHK-21 para uma concentração de 3,0 vezes 10 para a quinta células por mililitro em EGM. Mantenha as células preparadas frias até que estejam prontas para uso.
Em seguida, prepare o vírus CVS-11 diluindo-o em EGM. Certifique-se de manter o vírus preparado frio até ser usado. Limpe a câmara de lâmina de umidade e as lâminas de microscópio revestidas com politetrafluoretileno com etanol 70% e deixe-as secar ao ar livre no gabinete de biossegurança.
Após a limpeza, adicione água destilada às tiras de papel absorvente na câmara deslizante para garantir umidade constante durante todo o procedimento. Usando uma etiqueta a lápis cada slide com as informações de identificação necessárias, como o número do lote, data e tipo de célula. Coloque as lâminas rotuladas na câmara de slides para armazenamento.
Em seguida, aplique 50 microlitros de diluição de vírus nos poços nas lâminas do microscópio usando uma pipeta de repetição. Aplicar 50 microlitros de diluição celular em cada poço, tomando cuidado para não contaminar a ponta da pipeta com o vírus já no poço. Depois, feche a câmara deslizante de umidade e coloque-a na incubadora úmida entre 34 e 36 graus Celsius.
Em seguida, retire a lâmina da câmara de umidade e aspirar meticulosamente o sobrenadante. Lave a lâmina por dois minutos em um frasco de coplin preenchido com PBS e, em seguida, deixe secar ao ar. Coloque a lâmina em um frasco de coplina cheio de acetona fria para fixar a amostra.
Coloque o frasco em um freezer de menos 20 graus Celsius aprovado para materiais inflamáveis por pelo menos uma hora. Uma vez que a acetona evapora e a lâmina seca, aplique anticorpo fluorescente direto da raiva conjugado aos poços da lâmina e incube a lâmina por 30 minutos em uma incubadora úmida de 34 a 36 graus Celsius. Em seguida, lave a lâmina duas vezes em um frasco de coplin de PBS por dois minutos cada.
Seque a lâmina ao ar e monte a tampa com o triss 0,05 molar, cloreto de sódio 0,15 molar em montante de glicerol a 20%. Utilizar microscópio fluorescente com aumento de 200 vezes para avaliar a infectividade celular. Em seguida, remova as lâminas restantes da incubadora e da câmara de umidade.
Aspirar o sobrenadante de cada poço cuidadosamente. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco de coplin com PBS por um a dois minutos. Deixe as lâminas secarem ao ar por cerca de 30 minutos e, em seguida, guarde-as a 80 graus Celsius negativos até o uso.
