Para começar, prepare a diluição para amostras de soro ou líquido cefalorraquidiano do paciente para teste. Preparar o conjugado necessário na concentração de trabalho adequada, diluindo-o em PBS com 0,05% de Azul de Evans. Para testes de anticorpos fluorescentes indiretos, recupere o número apropriado de lâminas de antígeno preparadas necessárias para o ensaio.
Deixe as lâminas descongelarem e secarem completamente. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco Coplin cheio de acetona e transfira-as para um freezer de menos 20 graus Celsius aprovado para materiais inflamáveis por duas horas até a noite. Depois, retire as lâminas da acetona e deixe secar ao ar.
Agora, coloque as lâminas na caixa da câmara de umidade dentro do armário de biossegurança. Para manter a umidade, adicione tiras absorventes embebidas em água destilada à câmara. Aplicar 50 microlitros de cada amostra controle, diluição da amostra ou PBS no poço pré-determinado.
Coloque a câmara deslizante de umidade fechada a 37 graus Celsius, incubadora de umidade de dióxido de carbono a 5% por 30 minutos. Uma vez feito, remova a câmara deslizante de umidade da incubadora e transfira-a para um gabinete de biossegurança. Usando uma ponta aspiradora, aspirar cuidadosamente o sobrenadante de cada poço sem perturbar a monocamada celular.
Depois, aplique uma gota de PBS em cada poço usando uma pipeta conta-gotas estéril. Aspirar cuidadosamente o PBS e transferir cada lâmina para um frasco Coplin cheio de PBS. Em seguida, coloque as lâminas de volta na caixa da câmara de umidade.
Aplicar 50 microlitros do conjugado de anticorpos anti-humanos apropriado em cada poço e incubar por 30 minutos em uma incubadora úmida. Ao final da incubação, transfira a câmara de umidade para um gabinete de biossegurança. Aspirar o sobrenadante usando uma ponta aspiradora.
Depois, aplique uma gota de PBS em cada poço usando uma pipeta conta-gotas estéril. Depois de remover o PBS, lave a lâmina duas vezes em um frasco Coplin de PBS por um total de 15 minutos. Depois de lavadas, deixe as corrediças secarem ao ar e, em seguida, monte uma tampa com a mídia de montagem.
Pegue as lâminas e leia-as sob microscopia fluorescente. Classificar as amostras de negativo para quatro mais com amostras negativas mostrando nenhuma fluorescência e mais quatro amostras mostrando uma fluorescência verde brilhante. Atribua as amostras e o valor final representados pelo fator de diluição no qual a amostra exibe um grau de um a dois mais.
Após a vacinação inicial, níveis elevados de imunoglobulina M e G foram observados nas amostras de pacientes. Aproximadamente seis meses após a vacinação, níveis significativamente mais baixos de ambos os anticorpos estavam presentes nas amostras de pacientes, mas os níveis de imunoglobulina M haviam caído quase completamente. 18 meses após a vacinação, anticorpos contra imunoglobulina M não foram detectados em amostras de pacientes.
Os níveis de imunoglobulina G persistiram e permaneceram como aqueles detectados no período de seis meses após a diminuição inicial a partir do período de duas semanas.
