Para começar, ligue o microscópio, a fonte de luz, a câmera e o sistema de sucção. Para a lavagem do sistema de perfusão, utilizar solução de Ringer na primeira câmara e solução de zinco de Ringer suplementada com piritionato na segunda câmara. Depois de fechar a torneira, encha as câmaras com as mesmas soluções.
Para iniciar o preparo da amostra, coloque a câmara de perfusão com o lado estreito do sulco voltado para cima e aplique um silicone de vedação ao redor do sulco. Em seguida, usando um tweezer fino, transfira uma tampa de 13 milímetros da solução de lavagem no topo do sulco com as células voltadas para baixo. Coloque uma lamínula de 22 milímetros em cima da tampa de 13 milímetros e aperte-a usando o tweezer, tomando cuidado para não rachar as lamínulas.
Vire a câmara e pressione-a para liberar os líquidos. Em seguida, preencha o sulco com 100 microlitros da solução de lavagem de Ringer e pressione novamente, garantindo que não haja vazamentos. Monte e fixe a câmara de perfusão na plataforma.
Em seguida, fixar os tubos de perfusão e sucção para perfusão sobre as células no sulco. Altere a taxa de perfusão para aproximadamente dois mililitros por minuto e ligue a perfusão da solução de Ringer. Para medições, abra o software de geração de imagens.
Ajuste a ampliação do microscópio para 10X usando o botão do lado esquerdo do microscópio. Depois de escolher a Visualização dinâmica, use o joystick para mover a plataforma e se concentrar nas células no sulco. Selecione o comprimento de onda apropriado para mCherry.
Uma vez que as células estão focadas, mova a plataforma para a seleção de patches de células apropriados. Selecione o menu suspenso Desenhar ROIs. Escolha Desenhar ROIs circulares e desenhe ROIs em clusters de células com as células que expressam mCherry.
Crie novas ROIs além da primeira mantendo pressionado o botão Shift e, em seguida, pressionando e arrastando as ROIs existentes. Selecione Desenhar ROI de fundo quadrado no menu suspenso e ajuste o local e o tamanho do ROI de plano de fundo onde as células não estão presentes. Depois de garantir a ausência de células no ROI em segundo plano, vá para a guia Aquisição de ND.
Marque a subguia Comprimento de onda e marque sua caixa de seleção. Certifique-se de que a caixa de seleção para comprimento de onda GFP também esteja marcada. Clique na subguia Tempo e defina o intervalo de medição como a cada cinco segundos e a duração como 30 minutos.
No painel do microscópio, pressione o botão Ativado para ativar o Sistema de Foco Perfeito, ou PFS. Em ND Acquisition, certifique-se de que o PFS está marcado. Ajuste o foco e clique em Executar agora.
Iniciar a medição do período basal por 90 segundos usando a perfusão da solução de Ringer. Após 90 segundos, mude da perfusão da solução de Ringer para a perfusão da solução de zinco de Ringer e clique na bandeira vermelha no canto inferior direito do painel de interface principal quando o aumento da fluorescência começar a saturar. Volte para a perfusão com a solução de Ringer até que o tempo de experimento expire.
Para exportar os dados com subtração de linha de base, pressione o botão Correção em segundo plano e exiba as alterações na janela Aquisição de ND. Clique no botão Exportar para salvar os dados no local desejado. Um aumento na fluorescência resultou do aumento da concentração intracelular de zinco, enquanto uma diminuição indicou a atividade do ZnT-1 transportando zinco através da membrana celular.
O ZnT-1 selvagem apresentou curva de fluorescência mais suave que o mutante, relacionada à variabilidade nas respostas celulares à carga de zinco. Um box plot comparando as atividades do tipo selvagem e delta USCTD mostrou taxas médias de transporte semelhantes, indicando uma falta de diferença entre o tipo selvagem e o mutante. No entanto, a diferença no spread pode indicar uma diferença funcional.
