Comece polindo três pipetas de pastagem usando um queimador de bunsen, criando diâmetros decrescentes. Em seguida, esterilizar o abdômen de uma mãe de rata grávida eutanasiada com etanol 70%. Abra a cavidade abdominal da síntese púbica para o processo xifoide da caixa torácica.
Agora, extraia o corno uterino da cavidade abdominal e coloque-o em uma placa de 100 milímetros preenchida com solução gelada de HBSS. Extrair e separar todos os embriões do útero lavado usando pinças finas. Decapite rapidamente os embriões de camundongos extraídos e coloque as cabeças em uma placa de Petri de 60 milímetros cheia de HBSS.
Coloque um par de pinças finas na cavidade ocular para segurar o cérebro. Com outro par, descasque a pele e o crânio até que o cérebro esteja visível. Tire o cérebro dos bulbos olfativos do crânio e vire-o de cabeça para baixo.
Observe o córtex no lado ventral e o hipotálamo no lado dorsal. Use pinças curvas para remover a camada de meninges e vasos sanguíneos até que o cérebro pareça branco e claro, e separe a área hipotalâmica do resto do cérebro. Corte o hipotálamo em três a quatro pequenos pedaços finos e use uma pipeta para transferir as peças para um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, encha o tubo com seis mililitros de HBSS. Em seguida, adicione Enzyme Mix 1 uma vez que o tecido tenha se estabilizado e o sobrenadante removido. Incubar o tubo em banho-maria de 37 graus Celsius por 15 minutos, agitando a cada cinco minutos para ressuspender o tecido.
Agora, adicione 30 microlitros de Enzyme Mix 2 e dissociar o tecido pipetando para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de pastagem de grande diâmetro. Após mais 10 minutos de incubação, adicione os restantes 15 microlitros de Enzyme Mix 2. Utilizando duas pipetas polidas a fogo de diâmetro decrescente, pipetar o tecido 10 vezes.
Adicione imediatamente 10 mililitros de HBSS com 0,5% BSA ao tubo. Em seguida, centrifugar o tubo a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em um mililitro de HBSS com BSA 0,5%.
