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Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet

Transcrição

Para começar, adicione 200 microlitros do inóculo bacteriano a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 96 poços. Em seguida, adicione 200 microlitros de água deionizada nos poços mais externos para evitar que os poços internos sequem. Incubar a placa de 96 poços a 25 graus Celsius por 24 horas.

Após a incubação, descarte o sobrenadante em cada poço usando uma pipeta. Adicione cuidadosamente 300 microlitros de PBS a cada poço e remova o PBS novamente usando a pipeta. Adicione 200 microlitros de solução violeta de cristal a 1% a cada poço antes de incubar a placa à temperatura ambiente durante 30 minutos.

Em seguida, após a dispensação de 200 microlitros de etanol absoluto em cada poço, deixe a placa por 15 minutos em temperatura ambiente. Garanta uma mistura completa pipetando o conteúdo em cada poço para cima e para baixo repetidamente. Usando um leitor de microplacas, meça a absorbância dos poços a 595 nanômetros para determinar a massa do biofilme.

O número de biofilmes variou muito dependendo das cepas, variando de uma densidade óptica ou valor de OD de 0,04 a 1,69 Todos os isolados de Acetobacter, exceto A.bouvetii, formaram biofilmes, enquanto A.radioresistens formou um biofilme fraco. A.junii e A.baumannii formaram biofilmes moderados, e A.pittii e A.ursingii formaram biofilmes fortes.

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