Para começar, remova as tampas superior e inferior da coluna de rotação do kit comercial de enriquecimento de proteínas e guarde-as para uso futuro. Coloque a coluna de spin sem tampa em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Centrifugar a configuração a 1000 G e temperatura ambiente durante 30 a 60 segundos para remover e eliminar a solução de armazenamento.
Adicione 200 microlitros de tampão de lavagem às esferas de enriquecimento na coluna de rotação e misture pipetando para cima e para baixo várias vezes. Depois de centrifugar a coluna de spin como demonstrado anteriormente, descarte o buffer coletado. Substitua a tampa inferior e adicione 200 microlitros de água à coluna de rotação antes de substituir a tampa superior.
Misture a pasta aquosa preparada pipetando-a para cima e para baixo antes de transferir 40 microlitros para a amostra pré-preparada de anticorpo monoclonal do medicamento. Incubar o tubo girando-o à temperatura ambiente durante duas horas. Em seguida, faça furos em uma frita de tamanho adequado usando uma agulha de calibre 16 e insira-a na extremidade da ponta de uma ponta de 200 microlitros.
Transfira a amostra com contas para a ponta preparada e coloque-a em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros com um furo na tampa superior. Centrifugar a ponta do tubo para remover a solução. Lave as contas adicionando 200 microlitros de tampão de lavagem à ponta.
Remova o tampão de lavagem centrifugando a ponta em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Em seguida, lave as contas na ponta com 200 microlitros de água e centrífuga como mostrado anteriormente para remover a água. Agora, adicione 10 microlitros de tampão de eluição à ponta e mergulhe completamente as contas nela, pipetando a lama para cima e para baixo 10 vezes.
Transfira a ponta para um novo tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro com um orifício na tampa superior e centrifuga o tubo para coletar a proteína escapada. Adicione 1,5 microlitros de solução de tripsina no eluente e deixe digerir durante a noite a 28 graus. Em seguida, adicione 1,5 microlitros de 25 miligramas por mililitro de ditiotreitol à amostra e incube-a a 90 graus por 20 minutos.
Em seguida, incubar a amostra com 1,5 microlitros de iodoacetamida 0,25 molar à temperatura ambiente no escuro por 20 minutos. Depois disso, adicione 3,5 microlitros de ácido tricloroacético a 10% ou TFA e agite a amostra por dois minutos. Centrifugar a amostra a 14, 400 G durante 10 minutos à temperatura ambiente para precipitar SDC e SLS.
Recolher o sobrenadante acidificado para dessalinização. Adicione 50 microlitros de Buffer B à ponta de dessalinização GC. Em seguida, coloque a ponta em um suporte e centrifuja-a a 1000 G por três minutos em temperatura ambiente.
Adicione 50 microlitros de Buffer A à ponta e gire a ponta como demonstrado anteriormente. Agora, adicione a amostra acidificada à ponta. Centrifugar a ponta no suporte a 500 G durante seis minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, lave a ponta adicionando 50 microlitros de Buffer A e girando-a a 500 G por três minutos em temperatura ambiente. Eluir o peptídeo da ponta de dessalinização GC adicionando 50 microlitros de Buffer B e centrifugando a ponta em um novo tubo a 500 G por três minutos à temperatura ambiente. Depois disso, seque o eluente coletado usando um concentrador a vácuo.
Ressuspender o eluente seco em 30 microlitros de solução de ácido fórmico a 0,1%. Medir a absorbância ultravioleta das misturas peptídicas a 214 nanômetros usando um espectrofotômetro. Finalmente, transfira 10 microlitros da amostra digerida para um frasco de amostra de cromatografia líquida e analise um micrograma da amostra usando nano LC-MS/MS.
Os perfis de cromatograma de íons totais das proteínas da célula hospedeira revelaram que, em comparação com a digestão direta, a maioria dos principais peptídeos de anticorpos monoclonais foi reduzida ou eliminada após o enriquecimento proteico demonstrado juntamente com um protocolo de digestão limitado.
