Para começar, descongele o estoque de retrovírus RCAS(A) no gelo. Para evitar o entupimento da micropipeta, centrifugar a solução a 10.000 G por 10 segundos a quatro graus Celsius e transferir o sobrenadante para um novo tubo, mantendo as soluções no gelo. Coloque um parafilme de laboratório esticado em uma placa de cultura de células de 35 por 10 milímetros e adicione um microlitro de PBS estéril ao parafilme.
Conecte uma micropipeta de vidro preparada a um injetor automático Pico. Pressione o modo de enchimento para encher o PBS em uma micropipeta e, em seguida, pressione o modo de injeção para testar o microlitro de líquido alocado. Coloque um segundo pedaço de parafilme de laboratório esticado em uma nova placa de cultura de células e adicione um microlitro de estoque viral rapidamente corado de verde ao filme.
Abaixe a ponta da micropipeta para o estoque viral e pressione o modo de preenchimento para encher a micropipeta com um microlitro de estoque viral. Sob um microscópio dissecante, abaixe a micropipeta preenchida conectada a um injetor automático na região alvo da lente do embrião de galinha. Em seguida, ajuste a fonte de luz para fornecer uma visão clara da vesícula da lente.
Depois de garantir que a micropipeta esteja no local correto dentro do lúmen da lente, injete de cinco a 40 nanolitros do estoque viral. Após a injeção, aguarde 45 segundos antes de remover suavemente a micropipeta. Em seguida, verifique o sucesso da microinjeção examinando o corante verde rápido no lúmen vazio da lente sem vazamento.
Após o exame, sele a abertura da casca do ovo com fita adesiva e coloque os ovos em uma incubadora estática umidificada de 37 graus Celsius. Este estudo demonstra a avaliação histológica das alças quiméricas da conexão 50 e 43 por imunofluorescência. Usando a marcação Anti-Flag, as conexões exógenas foram distinguidas das endógenas.
O estudo também avalia a interação entre o domínio da alça intracelular da conexão 50 e Aquaporina zero.
